前言
乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisB virus , HBv ）引起的傳染性疾病，在我國人群中感染率較高，，是嚴重危害人民身體健康的常見傳染病之一。對乙肝的診斷主要以實驗室檢測乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）為主，檢測方法主要有酶免疫法、反向間接血凝法、放免法、化學發光法、免疫熒光法等，目前應用較廣、較普及的是酶免疫法。本標準所使用的縮略語為HBV 、HBsAg 。
本標準從2002 年7 月1 日起實施。
本標準由衛生部醫政司提出。
本標準由北京大學醫學部人民醫院肝病研究所負責起草。本標準主要起草人：陶其敏、全文斌。
本標準由衛生部委托衛生部臨床檢驗中心負責解釋。
中華人民共和國衛生行業標準
中華人民共和國衛生部2002-04-20 批準       2002-07-01 實施
乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗方法
WS / T 223 一2002
Guidelines for enzyme immuno 一assay of hepatitis B surface antigen
1 范圍
本標準規定了血清HBsAg 酶免疫檢驗方法（兩步法）中相關的技術要求。本標準適用于各基礎、臨床實驗室和流行病學研究中血清HBsAg 測定。
2 方法選擇
2 . 1 常用方法
HBsAg 的酶免疫檢驗方法根據反應模式可分為“一步法”和“兩步法”兩種方法。“一步法”是將待測樣品和酶標記抗體同時加人到反應孔中進行反應，從而達到快速的目的；“兩步法”則是先將樣品加人到反應孔中，待反應結束后再加人酶標記抗體，從而使待測樣品的“捕獲反應”和酶標記抗體的“酶聯反應”分開進行，因而反應更加穩定、重復性也更好。
2 . 2 推薦方法
由于“一步法”存在產生“前帶現象”的可能，故在本標準中不列為推薦方法；本標準推薦使用酶免疫“兩步法”。
2 . 3 方法原理
本標準推薦使用酶免疫“兩步法”檢測HBsAg ：將抗HBs 的單克隆抗體（簡稱單抗）或多克隆抗體（簡稱多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相載體上，加人待測血清，如其中含有HBsAg ，則可與固相上的包被抗體結合；洗板去除不參加反應的無關蛋白成分后，加人酶（如辣根過氧化物酶）標記的第二株抗體使之與血清中HB 、Ag 反應，在固相載體上形成包被抗體一血清中HBsAg 一酶標記抗體的復合物（即雙抗體夾心）；再加人底物后，酶催化底物，產生顯色反應，根據顯色反應顏色的深淺可判定血清樣品中HB 、Ag 的有無及相對含量。
3 試劑和材料
國內目前已有成套的試劑盒供應。
顯色反應底物液可選用鄰苯二胺（o-phenylenediamine 。OPD）過氧化氫（H202 。）溶液（簡稱OPD ）或3 , 3 ' , 5 , 5 ’-四甲基聯苯胺（3 , 3 ' , 5 , 5 ’一Tetramethylbenzidine , TMB ）-H2O2 溶液（簡稱TMB ）。使用OPD 時，可選用2mol / l的硫酸（H2SO4 ）作為終止液，比色時選用492nm 作為測定波長；使用TMB 時，可選用2 mol / l的鹽酸或2 mol / l 的硫酸溶液作為終止液，比色時選用450 nm 作為測定波長。注:國內市場目前亦有HBsAg 檢測的快速酶免疫試劑盒供應，該試劑盒系加有標本加速劑和酶標記抗體加速劑，可達到快速反應的目的，具體操作方法詳見各生產廠家的試劑盒說明書。
4 儀器和設備
包括酶標儀、移液系統（移液器及移液器頭）和恒溫設備（水浴箱）等。所選用的儀器設備應滿足以下要求：
a ）酶標儀在450 nm 和492 nm 的波長不精密度應在≤1 %，分別在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之間，吸光度（A 值）要求可以測到小數點后兩位；
b ）移液系統在100μl和50 μl 的移液不精密度應≤1 % ，分別在99- 101μl 和49.5μl-50.5μl 之間；
c ）恒溫系統在37 ℃ 、43℃ 的溫度變異應成士I℃ 。
樣品
5 . 1 血液樣品的采取
取受試者的前臂靜脈血。止血帶的使用時間應不超過1 min ，同時避免溶血。
5 . 2 血液樣品的處理、貯存和測定前準備
血液樣品采取后室溫下靜置30 min-45 min 使其凝血，避免溶血，2 O00r / min 離心5 min 后立刻吸出血清置密封的試管中貯存。
分離出的血清標本可于2℃-4℃ 貯存1 周，如需貯存更長時間，則應保存在-20℃ 以下，用時提前取出融化并使其溫度升至室溫，充分混勻后測定。保存在－20℃ 的標本應避免反復凍融，否則可能會影響測定結果的準確性。
注：HBsAg 的檢測亦可用血漿類標本，其抗凝劑可選用拘椽酸鈉（106 mmol / L 的水溶液與血液按1： 9 比例使用）、乙二胺四乙酸二鈉（15g / l ，的水溶液與血液按1： 9 比例使用）、肝素（100 u / mg ～ 125 u / mg 的肝素鈉粉劑配成1g/L的水溶液與血液按1 : 9 比例使用）等。
6 測定步驟
6 .1測定前準備
將貯存的成套試劑盒及待測血清樣品取出，使其溫度升至室溫后混勻使用。
準備或開啟儀器設備。
6 . 2 測定操作
a ）已包被好的微孔反應板中每孔加人待測血清50μl ，每次實驗均應設陰性、陽性對照及空白孔，37C 水浴或恒溫箱保溫30min;
b ）洗板3-5 次，每次均將各孔中注滿洗液，靜置20s以上，傾去液體，拍干；
c ）每孔中加人酶標記的抗體50μl ，保溫同前，洗板3-5 次，同前；
d ）每孔加人顯色底物液50μl , 37C 避光反應15 min -20 min 后加人終止液50μl。）酶標儀測定結果。
測定結果的表述和有效性判斷
7 . 1 測定結果的表述
加人終止液后，用空白孔校零，再讀取各孔的A 值，凡標本的A 值／陰性對照均值》 2 . 1 者判定為HBsAg 陽性，反之為陰性。
7．2 測定結果的有效性判斷
陰性對照及陽性對照孔所測A 值應在試劑盒的要求范圍內，否則應分析原因后重新測定。
注
1所得結果應表示至小數點后2 位；
2陰性對照均值為陰性對照各孔所測定A 值的均值，其CV 值應＜15 % ;
3 陰性對照均值<0.05 時按0.05 計算，> 0.05 時按實測值計算。
8 靈敏度、精密度和特異性
8 .1靈敏度
本方法的靈敏度一般應≥1 ng / ml ,應可檢側出adr 、adw 、ayw 三種亞型的HBsAg 。
8 . 2 精密度
應用本方法對同一份樣品進行檢測（> 10 孔），批內CV值應＜15 ％。
8 . 3 特異性
血清樣品中的抗壞血酸、血紅蛋白等物質可能為本方法的干擾物質，生理水平的上述物質應不明顯影響測定結果，某些試劑的配方設計和測定方式應可不同程度地減少上述物質的干擾。
9 安全注意事項
血清樣品和來源于血液的質控物質都可能含有致病微生物，應視為有傳染性的物質，必須按傳染病實驗室檢查規程進行操作，避免吞人口中或與皮膚接觸。