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丙型肝炎病毒核心抗原檢測的臨床診斷價值--山東萊博生物科技有限公司
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丙型肝炎病毒核心抗原檢測的臨床診斷價值
2011/8/8 打印

丙型肝炎是嚴重威脅人類健康的傳染病之一,由于至今尚無預防疫苗問世,也沒有特效藥物治療,因此早期診斷是防止丙型肝炎病毒(hepatitis C viral,HCV)傳播的有效手段。臨床上主要*實驗室診斷來輔助診斷HCV感染,了解患者體內(nèi)HCV復制的情況,常用的有丙型肝炎病毒抗體(HCVAb)HCV RNA。但是,HCVAb產(chǎn)生有一個明顯的窗口期,早期感染容易漏檢,對感染恢復后樣品產(chǎn)生誤判,而且由于不同廠商的試劑包被的HCV抗原片段有所不同,導致檢測結果缺乏可比性,故難以對感染后的進程及轉歸提供依據(jù)。PCR檢測HCV RNA靈敏度高,但影響因素也多,實驗室條件要求嚴格,且檢測費用昂貴。據(jù)文獻報道[1-4],HCV核心抗原陽性樣品HCV RNA陽性率為85%以上,兩者同步消長,具有極高的相關性。HCV抗原檢測能夠縮短HCV檢測窗口期,近幾年對這方面的報道陸續(xù)增多,具有可行性和較廣泛的應用基礎。本研究采用ELISA方法檢測丙型肝炎病毒抗原(HCVAg),對其臨床應用價值進行評價。

  資料與方法

  1.1  標本來源  選取20061112月我院住院及門診患者血清樣本91份,其中男44份,女47份;年齡1379歲,平均年齡47.7歲。所有病例選擇均符合2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會指定的《病毒性肝炎防治方案》中的診斷標準[5],并排除合并感染其他病毒性肝炎,排除心、腦、腎、肺等器官疾病及高血壓、糖尿病等。

  1.2  標本檢測

  1.2.1  ELISA檢測的簡要步驟:取樣本血清100 μl,加預處理液50 μl56℃水浴30 min。酶標板每孔加入100 μl樣品稀釋液(包括空白,陰、陽對照孔,空白孔需加入200 μl樣品稀釋液);加入100 μl陰、陽對照孔于相應孔,其余孔各加入100 μl經(jīng)預處理后的待測樣品;37℃水浴振蕩60 min。洗板6次。每孔加200 μl酶結合物,37℃水浴30 min,再洗板。最后顯色劑AB液各100 μl37℃水浴避光顯色10 min后加50 μl終止液。反應終止10 min內(nèi),以酶標儀450 nm波長測定各孔OD值。
   
  臨界值(cut off)確定:陽性對照每孔OD值>0.6,陰性對照孔OD值<0.1時,測定結果有效,其臨界值(cut off)為:陰性對照孔平均OD+0.06
   
  結果判定:待檢測樣品的OD值>臨界值判定為HCV抗原陽性,<臨界值判定為HCV抗原陰性。

  1.2.2  每份血清同時用ELISA法檢測抗HCV,檢測試劑由上海科華試劑公司提供。

  1.2.3  每份血清用ABI PRISM 7000PCR儀熒光定量逆轉錄聚合酶反應(PCR)檢測HCV RNA含量,檢測試劑由廣州達安基因股份有限公司提供。

  1.2.4  每份血清用日本Olympus Au 2700全自動生化分析儀測定ALT濃度,檢測試劑由第一化學藥品株式會社提供。

  1.3  統(tǒng)計學分析  采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,計數(shù)資料比較采用進行χ2檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

  結果

  2.1  62HCV抗體陽性標本中抗原的檢出率為22.6%29HCV抗體陰性標本中抗原的檢出率為6.9%,見表1。兩種樣品檢出率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.128P<0.05)

  2.2  16份抗原陽性標本中HCV RNA陽性14份,75份抗原陰性標本中有2RNA陽性者,二者符合率是70.3%。見表2

  2.3  29份抗體陰性標本中檢出抗原陽性2份,HCV RNA證實均為陽性。

 

1  HCV抗體陽性和陰性標本中抗原的檢出率情況(略)

  注:與HCVAb(-)比較,P0.05    

  表2  HCVAgHCV RNA的符合率情況(略)

        討論
   
  HCV的主要特征為具有較高的發(fā)展為慢性肝炎的趨勢,而且相當一部分患者可能發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。目前具有典型臨床表現(xiàn)的急性丙肝患者已經(jīng)很少見,故實驗室的早期診斷對控制HCV感染的傳播具有非常重要的意義,人們一直在致力于尋找和研究靈敏度高、特異性強、操作簡單、經(jīng)濟實用、易于推廣的檢測方法和檢測項目。
   
  人感染HCV后,存在一個相當長時間的病毒血癥陽性,血清抗體陰性,這一段時間稱為檢驗窗口期HCV在體內(nèi)復制活躍,傳染性很強。采用ELISA方法檢測HCV抗體(IgG)是臨床最常用的手段之一,從第1代試劑到第3代試劑的進步,大大提高了HCV抗體檢測試劑的靈敏度。但是,由于HCV具有高度的變異性,加上我國應用ELISA進行HCV檢測的試劑盒及試劑抗原來源各異,致使HCV陽性率有較大的差別。而且,IgG抗體陽性者無法判斷是否首次或再次新近感染,且效價高低并不能反映HCV感染的進程。鑒于IgM類抗體較IgG出現(xiàn)早,人們認為其效價高低在一定程度上可以代表急性期感染,在一定程度上也可以縮短HCV感染的窗口期,但是目前HCV IgM類抗體的檢測方法和臨床價值尚存在爭議。
   
  聚合酶鏈技術(PCR)應用于檢測HCV RNA,也可以極大地縮短窗口期,檢測HCV RNA具有高度靈敏度和特異性。但其操作要求、設備條件、工作環(huán)境均有較高的標準,其檢測的結果還與引物、參數(shù)的設計、試劑濃度和Tag酶的存在及儀器質量均有很大關系。
   
  應用ELISA法早期檢測丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)可以克服抗HCV ELISA篩選的局限從而達到縮短窗口期的目的,也是降低HCV感染的有效途徑之一。而且總HCV核心抗原檢測也可用于監(jiān)控慢性丙型肝炎患者體內(nèi)病毒載量,評價抗HCV治療效果。
   
  本文數(shù)據(jù)顯示62HCVAb陽性血清和29HCVAb陰性血清HCVcAg檢出率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示檢測HCVcAg具有一定的特異性。丙型肝炎病毒感染的患者在感染后14周內(nèi)血清HCV RNA轉陽,同時HCVAg出現(xiàn),隨后ALT增高和HCV抗體轉陽[5]。抗-HCV抗體不同于其他抗體,它不是一種保護性抗體,臨床上把它作為感染的證據(jù),但由于免疫功能的差異,部分患者感染后出現(xiàn)抗-HCV較晚,特別是免疫功能低下者或免疫抑制劑治療(經(jīng)常輸血的白血病)的患者可能不產(chǎn)生抗HCV抗體。急性期的檢出率低,部分病例可出現(xiàn)假陰性。故通過檢測HCVAg,可以縮短病毒感染窗口期,有助于篩查和早期診斷。
   
  本文29HCV RNA陽性血清檢出HCVAg應全部陽性,但本次實驗僅16個。導致HCVcAg陰性的原因可能有:(1)檢測抗原反應系統(tǒng)不穩(wěn)定,所取例數(shù)較少,存在抽樣誤差,導致其敏感性不高,特異性不好。(2)抗原出現(xiàn)早,抗體出現(xiàn)后與抗原結合,故檢測不出抗原的存在。(3)抗體出現(xiàn)晚,消失也晚,故當患者處于恢復期時,抗原消失抗體仍存在。此外,HCV是一種極易發(fā)生突變的RNA病毒,由于其基因突變率高,導致丙肝的抗原變異性大。
   
  本文16份抗原陽性標本中HCV RNA陽性14份,這一結果也進一步驗證了HCV抗原檢測方法的特異性,也提示抗原檢出的可能性。另外,尚有2份抗原陽性樣本未檢測出HCV RNA,推測樣本的保存條件在一定程度上影響PCR的結果,同時此方法也存在一些不足之處,其根本原因尚不明確,有望進行大量的進一步分析。
   
  在本研究結果中,發(fā)現(xiàn)29份抗體陰性標本中檢出抗原陽性2份,HCV RNA證實均為陽性,證明抗原檢測在一定程度上可以彌補抗體檢測的不足,更有效地控制HCV的傳播。

本文RNA陰性患者抗原無陽性,一致性較高,但其中仍有5例可疑,可給臨床提示存在HCV感染的風險。62RNA陰性患者血清抗原陰性,抗體仍有35份陽性。經(jīng)調查,這35例均為接受藥物治療患者,患者處于疾病恢復期,此時血中病毒核糖核酸水平處于低復制或無復制狀態(tài),血清中已無HCV RNA存在或病毒載量較低,定量PCRHCVAg無法檢出,但抗HCV仍未消失。
   
  陳安心等[6]利用Ortho公司的總HCV核心抗原檢測試劑和HCV RNA定量檢測技術共同檢測了116位接受聯(lián)合治療的患者的病毒血癥情況,結果發(fā)現(xiàn),在治療前和治療3個月后,總HCV核心抗原檢測的效果在治療早期(4周以內(nèi))要優(yōu)于HCV RNA檢測,在3個月后達到最佳效果。與HCV RNA檢測相比,在監(jiān)測治療和預測PEG修飾的干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療反應性上,監(jiān)測血清中總HCV核心抗原水平是一種精確和可*的方法,可替代HCV RNA定量檢測。
   
  有研究表明[7],與抗HCV相比,HCV抗原測定和HCV定量PCR都能顯著將HCV窗口期平均縮短至36 d,但HCV RNA檢測影響因素多,其中最重要的是防止核糖核酸酶(RNase)污染。所有器材均必須高壓滅菌,且需專業(yè)人員操作,應注意實驗人員手的污染,手套要完整并經(jīng)常更換。該實驗要求嚴格,成本高,價格昂貴。而HCV抗原ELISA檢測具有較高的敏感性及特異性,可明顯縮短HCV感染的窗口期,實驗只需3 h,操作簡便,成本較低,不需添加任何儀器設備就能完成,適合大規(guī)模篩查和大多數(shù)地區(qū)醫(yī)院的常規(guī)檢查。

【參考文獻】

   1 Nubling CM,Unger G,Chudy M,et al.Sensitivity of core HCV antigenand HCV RNA detection in the early infection phase.Transfusion,2002,42:10371045.

  2 Widel A,Molnegren V,Pieksma F,et al.Detectionofhepatitis Ccoreantigeninserumor plasaasamar kerofhepatitis Cviraemiain theserologicalwindowphase.Transfus Med,2002,12:107113.

  3 Sanz C,Tassies D,Costa J,et al.The first case of HCVinfection detected be fore seroconversion in blood donors tested by HCV core antigen ELISA.Lransfusion,2002,42:505506.

  4 aperche S,Le Marrec N,Simon N,et al.A new HCV corean antigen assay based on disassociation of immune complexes:an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infection.Transfusion tion,2003,43:958961.

  5 中華醫(yī)學會傳染病學會.病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志,2001195662.

  6 陳安心,童愛飛.患者輸血前血液傳染指標檢測結果分析.中華醫(yī)院感染學雜志,2004.14387389.

  7 張賀秋.丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑的臨床評價.中國醫(yī)學檢驗雜志,20067221223.

 

 

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