《中國實驗血液學雜志》> 2006年12月14卷6期>論著>

不同處理和保存條件下體外HCV RNA穩定性研究

作者：劉長利　任芙蓉　呂秋霜　劉景漢　莊輝

者單位：中國人民解放軍總醫院輸血科，北京 100853； 1北京市紅十字血液中心，北京 100088； 2北京大學醫學部病原生物學系，北京 100083

【摘要】  對獻血者或病人進行HCV核酸檢測時，如果標本的采集、處理、保存不當，會造成病毒核酸降解，從而影響檢測結果的真實性。本研究的目的是對不同抗凝劑、不同溫度、不同保存時間下的HCV RNA病毒穩定性進行研究，以考察常規采供血過程中，標本采集及保存方式對NAT檢測的影響。 采集7例HCV RNA陽性獻血者的血樣，采用不同的抗凝劑、經不同的溫度和不同的時間保存后，采用熒光定量PCR方法測定HCV RNA病毒含量，考察HCV RNA的穩定性。 結果表明： ①不同抗凝劑抗凝的全血于4℃保存48小時過程中, 病毒含量下降至原滴度的42.7%；EDTA抗凝組各時間點的滴度均低于其它3組（分別相當于其它3組的67.6%-25.1%）。②ACD抗凝的全血在4、25和37℃保存48小時，病毒含量分別下降到原滴度的53.8%、72.5%、29.8%。③ACD抗凝的全血離心分離出血漿，4℃或25℃繼續保存7天,病毒含量分別下降至原滴度的70.9%和25.1%。④ACD抗凝的全血分離的血漿，反復凍融4次，病毒含量下降到原滴度的38.9%。 結論： ①用于核酸檢測的標本應該用無菌采血管采樣；②在無菌采血管采樣的前提下，核酸檢測標本用未抗凝血、EDTA、ACD、CPDA抗凝血均可；③采集的全血應避免放置37℃以上，ACD抗凝全血在4℃、25℃保存48小時內、37℃保存14小時內,HCV RNA病毒仍較為穩定； ④分離后的血漿應避免放置25℃以上，ACD抗凝全血分離后的血漿在4 ℃保存7天，25 ℃保存3天，HCV RNA病毒仍比較穩定；⑤血漿標本應避免多次凍融，但凍融3次的血漿HCV RNA病毒含量仍然較為穩定；⑥無菌采樣對維持病毒的穩定性非常重要；單純的機械性溶血并不會明顯導致病毒的降解；只要注意無菌的問題和有合適的核酸提取方法去除血紅素，HCV RNA病毒實際上比以前認為的要穩定得多。

【關鍵詞】  丙型肝炎病毒； 丙型肝炎病毒RNA； 病毒穩定性； 保存條件； 抗凝劑

　　Stability of Hepatitis C Virus RNA in Various Processing and Storage Conditions

　　AbstractThe study was purposed to investigate whether processing and storage conditions might influence the stability  of the HCV RNA in whole blood or in plasma.  The samples obtained from seven patients known to be positive for HCV RNA  were kept in different storage conditions with different anticoagulants, and at the end of processing the plasma samples were frozen at   -80℃  until fluorescent quantitative PCR testing. The results showed that there was no significant loss of HCV RNA titers in whole blood anticoagulated with CPDA or ACD or EDTA or none（P>0.05）, while  diffe-rences in comparison of  the EDTA-anticoagulant storage condition with three other anticoagulants storage conditions at 4℃ after 48 hours were significant （P<0.05）. The HCV RNA level decreased to  53.8%,72.5% and 29.8% after 48 hours of storage of whole blood anticoagulated with ACD at 4℃, 25℃ and 37℃  respectively. The HCV RNA level of plasma samples stored at 4℃ and at 25℃  (room temperature) after 7 days   decreased to 70.9% and 25.1% respectively. After four freeze-thaw cycles the  HCV RNA level decreased  38.9% in plasma samples. It is concluded that the HCV RNA is stable relatively. The HCV RNA is resistant to degradation under routine laboratory handling and storage conditions or blood collection, transport and processing conditions. The influence of different anticoagulants on the stability of HCV RNA is different. Blood samples would better be stored at 4℃ after collection and plasma separated within 48 hours. And it is important for the stability of HCV RNA undergoing asepsis blood collection process.  HCV RNA remains stable at 4℃ for at least 7 days or at room temperature for 3 days, allowing greater flexibility in samples collection and transport in transfusion practice nowadays. HCV RNA in plasma samples subject to up to three short-term freeze-thaw cycles is still stable.

　　Key words HCV; HCV RNA; virus   stability;   storage condition; anticoagulant

　　血漿中HCV RNA病毒含量測定通常被用于評估丙型肝炎病人的療效及分析預后等。對于檢測結果的準確性來說，標本的采集、處理、保存是否得當是非常重要的。一般認為，RNA病毒離體后容易受到外界環境的影響而降解，因此對樣品的處理方式、保存溫度、時間、是否溶血等都有較高的要求。核酸檢測技術已在許多國家的獻血員血液篩查中應用，我國一些血液中心也在陸續進行一些核酸檢測可行性和必要性的評估工作。但目前，對于HCV RNA樣本的采集、處理、保存穩定性研究缺乏全面的報道，尤其是針對在采、供血機構中用于核酸檢測血液篩查標本的采集、處理、保存的標準未見報道。在本研究中，我們對不同抗凝劑、不同時間和溫度條件下處理和保存的HCV RNA病毒進行定量測定，以探討影響體外RNA病毒穩定性的因素。

　　材料和方法

　　樣本來源

　　血液樣本來自2003年到2004年北京血液中心無償獻血的獻血者中7例HCV RNA陽性且未經過治療的無償獻血者。

　　樣本采集

　　按照常規獻血員血液采集的標準操作規程和方法采集HCV RNA陽性者血液約100 ml，分別用ACD、CPDA、EDTA抗凝或不抗凝（未抗凝血）。采集后的血液立即移至百級凈化臺內進行無菌分裝，將3種抗凝血分裝于2 ml無菌Ep管中，每管1.0 ml，用于用不同抗凝劑采集血液、不同時間分離血漿（血清）及不同溫度保存全血的研究。將分裝完時作為0小時對照。同時將一部分ACD抗凝血置于50 ml無菌離心管中（美國Corning公司產品）,25℃放置6小時后1 000×g離心10分鐘分離血漿，然后分裝于1.5 ml無菌Ep管，每管0.5 ml，用于不同溫度保存的血漿及反復凍融血漿處理的研究。以上樣品處理操作均為無菌操作。

　　樣本處理

　　不同抗凝劑采集和保存的全血將未抗凝的血和CPDA、EDTA、ACD抗凝血置4℃冰箱中靜止保存，于1、3、6、12、24、48小時各取2管（Ep管），顛倒混勻3次后，4℃ 1 000×g離心10分鐘分出血漿或血清。此外CPDA、EDTA、ACD抗凝血于分裝后即刻離心分出血漿，作為0小時對照。 -80℃凍存，等待統一檢測。

　　不同溫度保存的全血選用ACD抗凝全血，分別保存于4℃冰箱、25℃水浴、37℃水浴，然后于1、3、6、12、24、48小時各取2管，顛倒混勻3次后，4℃ 1 000×g離心分出血漿或血清， -80℃凍存，等待統一檢測。

　　不同溫度保存的血漿選用ACD抗凝血25℃保存6小時離心后分裝的血漿，于4℃、25℃繼續保存1、3、5、7天， -80℃凍存，等待統一檢測。

　　凍融處理選用ACD抗凝于25℃保存6小時離心后分裝的血漿，做1-4次凍融處理，凍融條件： -80℃凍存至少1天；室溫1小時，顛倒混勻后，放入-80℃。 -80℃凍存，等待統一檢測。

　　RNA病毒含量檢測

　　使用Roche核酸提取柱提取核酸，用深圳匹基公司HCV熒光定量PCR檢測試劑盒和美國 Research公司的Opticon 熒光定量PCR檢測儀進行擴增和檢測。為避免核酸定量存在批間差異，每例HCV RNA陽性獻血者的所有處理樣品均在同一次Run中進行。

　　核酸提取使用Roche核酸提取柱，按試劑盒說明提取核酸。 每個2.0 ml離心管中加入200 μl待檢測樣本，各加入200 μl結合緩沖液（ binding buffer）工作液及50  μl蛋白酶K溶液，迅速混合均勻，于72℃溫浴15分鐘（HB-1000型恒溫金屬浴，杭州大和公司FerroTec產品）。各管中加入125 μl異丙醇，混合均勻，轉入加套管的提取柱，8 000×g離心1分鐘。將裝有濾出液的套管丟棄，換上新套管，向提取柱中加入500 μl除抑制物緩沖液（inhibitor removal buffer）工作液于8 000×g離心1分鐘；換上新集液管，向提取柱中加入450 μl洗滌緩沖液（wash buffer）工作液于8 000×g離心1分鐘；換套管，再次用450 μl洗滌緩沖液工作液洗滌后，首先以8 000×g離心1分鐘，然后13 000×g離心10秒以去除痕量的洗滌緩沖液。每個提取柱換上1.5 ml離心管，室溫放置3分鐘，向提取柱中加入50 μl洗脫緩沖液（ elution buffer），于8 000×g離心1分鐘收集濾出液，于4℃保存備用。

　　核酸擴增和檢測采用深圳匹基公司HCV熒光定量PCR檢測試劑盒，美國Opticon 熒光PCR儀進行檢測。按試劑盒要求配制反應液。每個反應體系含： HCV RT-PCR反應液29.6 μl, Enhancer 0.4 μl,  RT-PCR逆轉錄酶0.25  μl。 取待測樣品濾出液或陽性參控品各20 μl, 反應總體積50 μl, 擴增和檢測參數為： 42℃  30分鐘;95℃ 3分鐘;95℃ 10秒；55℃ 30秒；72℃ 60秒，共5個循環;然后95℃ 5秒,60℃ 30秒,共42個循環，然后讀取熒光。
結果判定擴增的結果由儀器軟件自動分析給出結果。

　　實驗數據可靠性為避免核酸定量存在批間差異，同1例HCV RNA陽性獻血者的所有處理樣品均在同一次Run中進行。為確保定量工作的準確性，采用了Roche核酸提取柱以確保核酸提取過程中的回收率和重復性。實驗所用的匹基公司的熒光PCR核酸檢測試劑是國內最早獲得批準文號的HCV PCR臨床診斷試劑。本實驗室于2003年5月被衛生部臨床檢驗中心批準為核酸檢測實驗室，并曾使用該方法進行了大標本量的核酸檢測工作［1］。

　　統計學分析

　　凍融對HCV RNA的影響采用SPSS 10.0軟件進行雙因素方差分析，其它組內統計資料采用SPSS 10.0軟件進行重復測量方差分析；組間統計資料采用SAS 6.12軟件進行重復測量資料趨勢性方差分析。

　　結果

　　HCV RNA陽性獻血者病毒含量

　　本研究中的7例HCV RNA陽性獻血者病毒含量見表1。7例陽性標本經采血后立即檢測，其HCV RNA病毒含量都在106copies/ml左右，均屬于HCV病毒強陽性標本。Table 1. Amount of HCV RNA of seven untreated donors（略）不同抗凝劑對全血中HCV RNA穩定性的影響

　　用不同抗凝劑抗凝的全血于4℃保存48小時,其HCV RNA的變化見表2。結果表明，各抗凝組在4℃保存48小時過程中，病毒含量均略有下降，下降幅度不大，≤0.37 Log,亦即各處理組4℃保存48小時的病毒滴度下降至原滴度的42.7%。但EDTA抗凝組各時間點平均低于其它3組0.17-0.60 Log（重復測量資料趨勢性方差分析P<0.05），即其它3組的67.6%-25.1%。

　　不同保存溫度對全血中HCV RNA穩定性的影響

　　表3為ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存0-48小時 HCV RNA含量變化。ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存48小時，病毒含量均略有下降，分別下降了0.27、0.14和0.56 Log,相當于下降原病毒滴度的53.8%、72.5%、29.8%。Table 2. Impact of different anticoagulants on the stability of HCV RNA in 4℃ strored whole blood  （略）Table 3. Impact of different strage temperatures on the stability of HCV RNA in whole blood （略）

　　不同溫度下保存的血漿樣品中HCV RNA的穩定性

　　ACD抗凝的全血離心分離出血漿后，在4℃和25℃繼續保存過程中HCV RNA含量的變化見表4。由表4可見，保存過程中病毒含量均略有下降，4℃和25℃繼續保存7天,分別下降了0.15  Log和0.60 Log,相當于下降至原病毒滴度的70.9%和25.1%。Table 4.  Impact of storage  at different temperatures on the stability of HCV RNA in plasma samples （略）

　　反復凍融對HCV RNA的穩定性的影響

　　ACD抗凝的全血分離的血漿，經過-80℃/室溫反復凍融1、2、3、4次，病毒含量略呈下降趨勢，與未凍融組（對照）比較，凍融4次組病毒含量下降了0.41 Log,也即下降到原滴度的38.9%(P<0.05)（表5）。Table 5. Impact of repeat freeze-thaw  on the stability of HCV RNA in plasma samples （略）

　　討論

　　本項實驗研究重點考察不同種類的抗凝劑、溫度及凍融次數對HCV RNA病毒的影響。結合國內采供血機構特點，采用了幾種常用的抗凝劑，并在處理時間設計上考慮到街頭血液采集的特殊性，做出了相應的調整。臨床標本常用肝素和EDTA抗凝，由于肝素是一種非特異的核糖核酸酶抑制劑，不能通過酚提法將其去除，對PCR檢測有嚴重干擾［2,3］，因此臨床用于核酸檢測的標本常用EDTA抗凝。在采供血系統，常用ACD、CPDA作為全血的保養液，它們既有抗凝劑的作用，又有保護紅細胞的作用，使得血液中的紅細胞在其有效保存期內維持完整的結構、活性和功能。如果在獻血者中實施核酸檢測，是否可以用ACD、CPDA抗凝的血呢？各種抗凝劑的效果如何？因此，本研究重點對EDTA、ACD、CPDA三種抗凝劑及非抗凝血（作為對照組）進行了研究。本研究結果顯示，各處理組在4℃保存48小時過程中，病毒含量均略有下降，但下降幅度不大，非抗凝組、ACD抗凝組及CPDA抗凝組全血4℃保存48小時時，病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至原來的50%以上。這一結果說明在4℃的環境下，不論抗凝或不抗凝，全血樣本中RNA病毒均較為穩定。本研究中，我們發現一個與預期結果不一致的現象，EDTA組在采血后即刻及各時間段的含量均低于其它3組0.17-0.60 Log（重復測量資料趨勢性方差分析P<0.05），即分別相當于其它3組的67.6%-25.1%。我們曾擔心，ACD抗凝劑可使血液樣品稀釋20%（200 ml全血中需加入ACD抗凝劑50 ml），CPDA抗凝劑也使血液樣品稀釋了12.5%（200 ml全血中需加入ACD抗凝劑28 ml），會影響到病毒含量的測定值（可能會低于EDTA組）。但研究的結果卻是， EDTA抗凝組從采血后即刻起就低于其它3組。在分析原因時，我們注意到雖然后續樣品處理均為無菌操作，但從生產廠家了解到，本研究所用的EDTA抗凝真空管（北京創格醫療公司生產）僅僅是抽了真空，但并未做無菌處理。由此，EDTA抗凝組偏低的原因可能是由于非無菌造成的，是由于抗凝劑內和采血管壁上存在的外源性RNase引起的。王露楠等［4］發現，采用未滅菌的普通一次性塑料試管和滅菌離心管收集血樣，即使凝集后立即離心，前者比后者平均下降37.3%；黃呈輝［5］等曾發現用未高壓滅菌的玻璃試管留取標本于4℃保存至第2天分離出血清或血漿，在12份抗 HCV陽性的標本中,僅檢出2份HCV RNA陽性,HCV RNA在儲存中被降解或丟失。因此，我們認為核酸檢測標本應注意無菌留樣。本研究中，趨勢性分析比較表明，未抗凝組與ACD抗凝組及CPDA抗凝組間差異無顯著性（P>0.05），這一結果與一般認為的RNA病毒在未抗凝血中的穩定性較差［4,6］不符。我們認為，可能與所采用的測定方法不同有關。有研究表明，血紅素可通過其卟啉環與Taq酶的不可逆結合而抑制Taq酶活性，從而會嚴重影響PCR測定［7，8］。本研究中，未抗凝組標本在標本離心前剝離、分裝血清處理過程中，部分標本溶血現象非常明顯，但核酸定量測定結果顯示未抗凝組核酸量并未偏低。本研究中采用Roche核酸提取柱提取核酸，在提取過程中去除了血紅素分子，避免了血紅素分子對Tag酶的抑制作用，因此溶血標本中核酸含量測定值沒有偏低。此外，就溶血會不會影響HCV RNA測定的問題，本研究曾將HCV RNA陽性donor  1標本分別用無菌采集的未溶血的陰性血漿及無菌采集的嚴重溶血的陰性血漿稀釋至濃度為1×104 copies/ml的HCV RNA低拷貝標本，4℃過夜使紅細胞中釋放的RNA酶有機會充分降解 HCV RNA, 第二天用美國Chiron 公司的Procleix HIV/HCV Assay 血液篩查試劑（國際公認定性血篩試劑）進行檢測，結果嚴重溶血的標本并未影響標本中HCV RNA的檢出。Procleix HIV/HCV Assay檢測系統中核酸提取采用磁珠吸附的方法，可去除血紅素。這些結果都說明單純的機械性溶血并不會引起 RNA的明顯降解；如果能在擴增模板制備時將血紅蛋白去除，則單純的機械性溶血不會影響擴增。2003-2004年，北京血液中心常規采集獻血者血液90%以上用ACD抗凝，因此本研究關于保存溫度、凍融對穩定性的研究均采用了ACD作為抗凝劑。由于采血現場條件的限制，采集的標本不可能即刻分離出血漿；此外，標本的儲存條件可能受限制，有時有4℃冰箱，有時可能只能室溫環境放置。為了調查采集的全血標本分離血漿時間不同以及儲存溫度不同對RNA穩定性的影響，我們對ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存0-48小時 HCV RNA含量變化進行了研究。研究結果表明，ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存48小時過程中分別下降了0.27 Log、0.14 Log和0.56 Log,相當于下降到原病毒滴度的53.8%、72.5%、29.8%，可以看出，37℃保存時RNA降解最快。研究表明，ACD抗凝全血在4℃、25℃保存48小時，在37℃保存14小時,HCV RNA病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至50%以上，仍可認為較為穩定。本研究發現一個較反常的現象是，ACD抗凝全血在4℃保存過程中其HCV RNA的含量均略低于25℃保存血，似乎無法解釋為什么4℃放置后要比室溫降解快。但Wang等［3］和Fong等［9］采用連續倍比稀釋法檢測室溫和4℃放置5d或48h 的標本，也得到類似的結果。王露楠等［10］認為這一現象可用粒細胞釋放的蛋白酶及核酸酶對病毒顆粒的降解作用來解釋，因為粒細胞的裂解作用在4℃比在室溫更強。勿容置疑，血漿標本若需較長期保存，應該凍存，但血漿標本短期保存時，凍存和液態保存那種更可取？此外，檢測前的標本取樣一般在室溫條件下進行，如果標本數量多，取樣過程需要5-6個小時，有時甚至需要進行多次檢測，那么室溫放置是否影響病毒含量？本研究表明，ACD抗凝分離的血漿在4℃或25℃繼續保存7天,病毒滴度分別下降了0.15  Log和0.60 Log,相當于下降到原病毒滴度的70.9%和25.1%。25℃保存時RNA降解較快。分離后的血漿在4 ℃保存7天，25 ℃保存3天，HCV RNA病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至50%以上，這仍可認為較為穩定。Brush等［11］用半定量的方法發現，血清標本在4℃保存7天HCV RNA含量無明顯降低。Gessoni等［12］發現，4℃放置7天的血漿(5.025 Log)，比4℃ 0天時(5.492 Log)下降0.467 Log。Traband等［13］發現，于密閉SST管分離后的血清在4℃或室溫放置3天，HCV RNA均穩定，HCV RNA下降≤0.5 Log。Halfon等［14］研究表明， 4℃保存5天的血漿HCV RNA減少4.8%。本研究結果與這些結果相一致。但Halfon等［14］報告，室溫保存5天的血漿HCV RNA丟失100%。上述結果不一致，究其原因有方法學方面的問題（標本采集、處理條件，檢測方法等），也可能與被檢樣本數過少有關。標本反復凍融會引起病毒RNA的降解。但標本的凍融有時又是難以避免的。那么凍融究竟有多大的影響呢？凍融多少次是可以接受的呢？本研究ACD抗凝血離心獲得的血漿經過-70℃/室溫反復凍融1、2、3、4次處理，與未凍融組（對照）比較，凍融1-4次標本組的病毒含量分別下降了0.09 Log,0.11 Log,0.25 Log和0.41 Log, 即血漿凍融3次HCV RNA病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至原滴度的50%以上。王露楠等［3］報道反復凍融3次未發現明顯差異，Halfon［14］等報道反復凍融5次，HCV RNA含量降低16%。

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