王麗　滕曉梅　權(quán)翠俠

（徐州市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州　221002）

　　[ 摘要] 目的：探討丙肝抗原檢測（ELISA 法）加樣后改變反應(yīng)溫度及時間對檢測結(jié)果的影響。方法：對234 例樣本分別在37 ℃溫育90min 及在43 ℃溫育45min 的條件下檢測丙型肝炎病毒核心抗原（HCV-cAg）的S/ CO 值。

結(jié)果：兩種溫育條件對于樣本陽性檢出率、吸光度值、S/CO 值沒有顯著影響。結(jié)論：適當(dāng)?shù)靥岣邷赜郎囟燃翱s短溫育對HCV-cAg 的檢測結(jié)果影響不明顯。這有助于縮短臨床檢驗工作者的工作時間，盡快報告結(jié)果，提高工作效率。

　　[ 關(guān)鍵詞] 丙型肝炎病毒核心抗原　酶聯(lián)免疫吸附試驗　溫育

The affect of reaction incubation conditions for detecting Hcv-cAg by ELISA method

WANG Li, TENG Xiao-mei, QUAN Cui-xia

(Department of clinical laboratory, The first people's hospital of Xuzhou city, xuzhou, jiangsu 221002)

　?。?/SPAN>Abstract］Objective ：In this study, we discuss the effects of incubation temperature and incubation time on results ofhepatitis C virus core antigen in the reaction between packet-antibody and antigen by ELISA. Methods:234 samples were incubatedat 37 ° C for 90 min and 43 ℃ for 45min to the detect S / CO value of the hepatitis C virus core antigen (HCV-cAg) separately.

Results:The results suggested that there were no significant changes among the samples positive, absorbance and S / CO value under two incubation conditions . Conclusions:The appropriate increase of incubation temperature and shorter incubation time did not change the results of the HCV-cAg by ELISA. It is helpful for clinical laboratory workers to save work time and improve work efficiency.

［Key words］HCV-cAg; ELISA; Incubation

酶聯(lián)免疫吸附試驗( ELISA) 是目前臨床上最為常用的感染性疾病血清學(xué)標(biāo)志物免疫測定方法之一。但在臨床實驗室實際工作中, 經(jīng)常存在測定結(jié)果差異很大的情況。溫育是影響檢測結(jié)果的最關(guān)鍵因素。溫育時間及溫度對ELISA 檢測乙型肝炎血清標(biāo)志物的影響已有相關(guān)報道, 而在丙肝抗原檢測方面未見報道，因此我們采用加樣后43 ℃溫育45 分鐘與原反應(yīng)條件（加樣后37℃溫育90 分鐘）進(jìn)行比較，探討加樣反應(yīng)條件的改變對測定結(jié)果的影響，為臨床應(yīng)用提供實驗參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象　

所采用的樣本來自徐州市第一人民醫(yī)院檢驗科從2013 年3 月-5 月份檢驗完畢之后的血清樣本234 例，包括丙肝抗原陽性樣本58 例，該58 例陽性樣本經(jīng)HCV-RNA 進(jìn)行補充實驗或跟蹤復(fù)查進(jìn)行了確認(rèn)。

1.2 試驗方法及試劑　

1.2.1 樣本檢測方法 采用酶聯(lián)免疫（ELISA）雙抗體夾心法檢測血清中丙型肝炎病毒核心抗原，所用ELISA 試劑盒為山東萊博生物技術(shù)有限公司丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒（批號為201302001）。操作過程參照試劑盒說明書，簡述如下：

將234 例標(biāo)本同時分別在37 ℃溫育90 min 及43℃溫育45min 后，加酶液37℃溫育30min，加顯色劑顯色10min 終止反應(yīng)觀察結(jié)果，記錄樣本在不同溫度下的OD 值、S/CO 值。通過對陽性檢出率及精密性等指標(biāo)的比較，探討不同溫育條件對檢測結(jié)果的影響。

1.2.2 精密性比較檢測 選取2份HCV 感染血清中HCV 核心抗原測定結(jié)果為陽性的樣本A（S/CO=1.56），B（S/CO=6.4），1 份HCV 感染血清中HCV 核心抗原測定結(jié)果陰性的樣本C（S/CO=0.44），按1.2.1 的操作步驟進(jìn)行檢測，A、B、C 各測10 孔/ 次；結(jié)果以S/CO 值表示，計算均數(shù)及CV 值。

1.3 儀器 杭州博日水浴箱（HB-100）；美國伯樂酶標(biāo)洗板機（BIO-RAD）；瑞士奧斯邦全自動酶免分析儀（E-SIAR）。

2 結(jié)果

2.1 不同溫育條件HCV 核心抗原初次測定結(jié)果實驗表明，234 例樣本在37 ℃溫育90 min 條件下，共檢出陽性樣本58 例、陰性樣本176 例，陽性檢出率為23.87%。234 例樣本在43 ℃溫育45 min 條件下，共檢出陽性樣本53 例、陰性樣本181 例，陽性檢出率為21.81%。經(jīng)χ2 檢驗，P<0.05，Kappa=0.941>0.75，表明兩種溫育條件并沒有對樣本陽性檢出率造成顯著影響，一致性良好。有5 例樣本43 ℃溫育45 min 檢測為陰性而37 ℃溫育90 min 為陽性，該5 例樣本37℃溫育90 min 檢測為弱陽性（1<S/CO<1.2），而43 ℃溫育45 min 檢測為可疑（0.8<S/CO<0.99）。

表1 37℃溫育和43 ℃溫育條件下HCV 核心抗原初次測定結(jié)果S/CO 值分布表

表2 樣本陽性檢出率χ2 檢驗

注：χ2=207.921，P<0.05，Kappa=0.941

2.2 不同溫育條件下陽性樣本、陰性樣本下吸光度和S/CO 值對比

表3 6 例出現(xiàn)陰陽性判斷差異S/CO 值

對比發(fā)現(xiàn)，37℃溫育90min 和43 ℃溫育45mi 共有6 例出現(xiàn)陰陽性判斷差異。其中有5 例樣本在37℃處理時檢測為陽性，43 ℃溫育處理時檢測為陰性。有1 例樣本在37℃處理時檢測為陰性，43 ℃溫育處理時檢測為陽性。且以上結(jié)果有差異樣本均為弱陽性（1<S/CO<1.2）。對比58 例樣本在37℃溫育處理和43 ℃溫育處理下S/CO 值可以看出37℃反應(yīng)條件下有39 個樣本的S/CO 值比該樣本在43 ℃時樣本的S/CO 高。從陽性樣本S/CO 均值上看，37 ℃溫育90 min 得到的均值比43 ℃溫育45 min 得到的均值高0.08，高出1.12%，差異不顯著。另外，實驗中43℃溫育45min 時陰性樣本值比37 ℃值高。

表4 37℃溫育和43 ℃溫育條件下陽性樣本、陰性樣本吸光度和S/CO 值對比均值測定結(jié)果

實驗表明，243 例樣本在37 ℃溫育90 min 條件下，S/CO 均值為4.79。243 例樣本在43 ℃溫育45 min 條件下，S/CO 均值為4.71。

2.3 方法內(nèi)和方法間精密度

如下圖所示，方法間離散指數(shù)CV 值均小于10%，說明以上樣本測定結(jié)果可靠。

表5 方法間精密度評估結(jié)果

3 討論

ELISA 反應(yīng)是抗原、抗體的結(jié)合在固相表面上發(fā)生的一系列的反應(yīng)，抗原抗體結(jié)合是一個逐步平衡的過程，需要經(jīng)過擴散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。因此，ELISA 反應(yīng)需要一定時間的溫育[1]。溫育常采用的溫度是43℃、37℃、室溫和4℃，其中最常用的是37℃，也是大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)的適合溫度[2]。在臨床ELISA 法測定中，檢驗工作者往往要同一時間處理大量的樣本并且要獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，這需要大量的時間和精力。丙肝抗原檢測中（ELISA）加樣反應(yīng)條件為37℃溫育90 分鐘，比較耗時。在乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗方法的國家中標(biāo)準(zhǔn)（ws/T 223-2002），提到加樣后的反應(yīng)條件為37 C 水浴或恒溫箱保溫2h 或43 C 保溫1h，另根據(jù)阿侖尼烏斯方程式，提高反應(yīng)溫度可以縮短反應(yīng)時間，在丙肝抗原檢測中是否可以采用提高反應(yīng)溫度縮短反應(yīng)時間，以提高工作效率，盡快報結(jié)果，因此我們設(shè)計本實驗使樣本中的抗原與包被抗體在水浴43℃下反應(yīng)45min，與在37℃下反應(yīng)90min 的結(jié)果作比較，研究結(jié)果表明，兩種溫育條件在大多數(shù)陽性樣本及陰性樣本其陰陽性檢出率、吸光度值、S/CO 值沒有顯著差異，但在0.8<S/CO<1.2的樣本易產(chǎn)生波動及差異。

根據(jù)本次研究結(jié)果，筆者認(rèn)為在丙肝抗原檢測在初次檢測時可以采用43℃反應(yīng)45min 的溫育條件進(jìn)行操作，另設(shè)定灰區(qū)（0.8<S/CO<1.2），對檢測為灰區(qū)的樣本再可按造產(chǎn)品說明書中的設(shè)計37℃反應(yīng)90min 進(jìn)行復(fù)查，按此方法既可以縮短反應(yīng)時間，以提高工作效率，盡快報結(jié)果，同時對灰區(qū)樣進(jìn)行復(fù)查，也更以更好地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn):

[1] 李天君, 張印則. 影響E L IS A 檢側(cè)結(jié)果的因家[J]。中國輸血雜志，2000,13（4）：250。

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[3] 陳　鵠, 劉慶菊。溫育溫度及時間對ELISA 快速一步法檢測乙型肝炎標(biāo)志物的影響[J]。南華大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2006,34（1）：138-139。

醫(yī)學(xué)檢驗與臨床　2013 年第24 卷第6 期          Medical Laboratory Science and Clinics,2013,Vol24,No.6

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