陳明泉 , 孫  峰
( 復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040)
摘要 ：直接抗病毒藥物 ( DAA) 的研究是慢性丙型病毒性肝炎 ( CHC) 治療藥物的重要研究方向，丙型肝炎病毒 ( HCV) NS3/4A 絲氨酸蛋白酶 (NS3/4A SP) 對病毒蛋白前體加工成熟和病毒復制過程十分重要，是抗 HCV 治療的理想靶點。本文重點綜述 NS3/4A 絲氨酸蛋白酶抑制劑特拉潑維 (telaprevir) 和博賽潑維 (boceprevir) 治療 HCV 感染的最新進展。 關鍵詞 ：蛋白酶抑制劑 ；聚合酶抑制劑 ；干擾素 ；特拉潑維 ；博賽潑維 ；丙型肝炎Advance in the development of directly anti-HCV agents: telaprevir and boceprevir
CHEN Ming-quan, SUN Feng.
(Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)
Abstract ：Development of directly acting antivirals (DAAs) is important to drug therapy for chronic hepatitis C (CHC). Hepatitis C virus (HCV) NS3/4A serine protease is the vitals for the processing and maturation of viral protein pre- cursors and RNA replication. This review focuses on the recent advances in the development of directly anti-HCV agents telaprevir and boceprevir.
Keywords ：protease inhibitor ；polymerase inhibitor ；interferon ；telaprevir ；boceprevir; hepatitis C
慢性丙型肝炎病毒 (HCV) 感染是一個全球性的 健康問題，但現有治療方法對 HCV 基因 1 型感染 者有效率不足 50%[1]。近十年來，鑒于細胞培養系 統等技術領域的進步，有關直接作用于 HCV 的抗 病毒藥物 (DAA) 的研發大大加速。目前在該領域已 進行或正在進行的藥物臨床研究多達 50 多項，其中 多種 NS3/4A 絲氨酸蛋白酶抑制劑類新藥已進入 III 期臨床研究階段。從已有的研究結果看，DAA 具有 強效抑制 HCV 復制的能力，可迅速降低血清 HCV RNA 水平，并有縮短療程的潛力，然而單藥使用易 產生不同程度耐藥。有報道 [2] 稱臨床使用 DAA 引 發的藥物耐受性問題較為嚴重。目前，抗 HCV 感染治療的研究熱點為探討最理想的療程、DAA 聯合 聚乙二醇化干擾素和核苷類似物的治療時機、聯合 方式及長期療效。本文概述目前 NS3/4A 絲氨酸蛋 白酶抑制劑治療 HCV 感染的最新進展。
1   HCV 特異性靶向治療
HCV 屬于黃病毒屬正鏈 RNA 病毒，基因組約 為 9.6 kb。該基因組編碼一個多聚蛋白，該蛋白被 剪切為 10 個結構片段 ( 衣殼，包膜糖蛋白 ) 和非結 構 (NS2–NS5B) 蛋白 [3]。許多非結構蛋白都可以作 為抗病毒藥物的潛在靶點 [4,5]。以往缺乏感染 HCV 的小動物模型，難以研究病毒的生活周期以及確定 潛在的治療靶點。近 10 年來，隨著基因組 HCV 復 制模型的重大突破，上述研究成為可能。現有的 細胞培養系統可支持肝細胞株內全長度自主 HCV 141的細胞培養模型只能針對 1 型 HCV 病毒復制，加 上美國和西歐各國的丙型肝炎患者以 1 型 HCV 感 染為主，DAA 的進展主要針對 1 型 HCV，但針對 其他基因型 HCV 的藥物研究也在不斷擴展。此外， 除了病毒復制系統可支持 RNA 復制研究外，近期 研究 [7] 表明，組織培養也可用于研究 HCV 生活史 和潛在復合藥物的篩選等。非結構蛋白依然是藥物直接作用的基本靶點， 包括病毒 RNA 依賴的 RNA 聚合酶 (NS5B) 和絲氨 酸蛋白酶 (NS3) 及其輔助因子 ( NS4A)。病毒復制 需要 NS3/NS4A 絲氨酸蛋白酶的參與，它的主要職 能是參與翻譯后修飾 [8]。體外試驗 [9,10] 顯示它能通 過對細胞內Ⅰ型干擾素信號通路的調節，抑制針對HCV 感染的固有免疫反應。這類作用于蛋白質的高 度選擇性抑制劑成為藥物研究的主要關注點，當然也包括其他作用位點，如病毒受體結合以及病毒釋 放等。早期有關重組人親環素 B 抑制劑和其他免疫調節藥物的研究均發現具有潛在開發價值的品種。然而，病毒復制時的高自然錯配率 ( 大約每個基因每次復制周期可發生 1 個核苷酸錯配 ) 及 RNA 聚 合酶的低保真性導致 HCV 基因極易突變，產生耐藥，成為 DAA 臨床研究中的主要挑戰。
2  療效評估
DAA 研究最多的是 NS3/4A 絲氨酸蛋白酶的肽 類抑制劑。第一個蛋白酶抑制劑 BILN2061 為 DAA 奠定了基礎，該蛋白酶抑制劑可使 1 型 HCV 感染 者病毒載量迅速下降。但動物試驗提示其存在心 血管毒性因而并未進入臨床 [11]。另外 2 個有效的 NS3/4A 蛋白酶抑制劑特拉潑維 (telaprevir) 和博賽 潑維 (boceprevir) 現已上市。Ⅱ b 期蛋白酶抑制劑研究包括美國的PROVE-1(250 例 ) 和歐洲的 PROVE-2(334 例 )。這兩項隨機對照研究均在 1 型 HCV 感染的初治患者 中實施完成。PROVE-1 研究 [12] 采用特拉潑維聯合 聚乙二醇化干擾素與利巴韋林或單獨聯合聚乙二醇 化干擾素治療，與標準治療( SOC) 方案 ( 聚乙二 醇化干擾素聯合利巴韋林治療 48 周) 對比，3 藥聯 合治療 ( 特拉潑維聯合聚乙二醇化干擾素與利巴韋 林 ) 12 周后再用 SOC 鞏固治療 12 周治療組的持續病毒學應答 ( SVR，即治療結束 24 周后血清 HCV RNA 未檢獲) 率為 61%，SOC 組為 41%(P=0.02)， 3 藥聯合治療 12 周后再用 SOC 鞏固 36 周治療組 SVR 率為 67%，與鞏固 12 周治療組相比差異無統 計學意義 ( P=0.51)，但 3 藥聯合治療 12 周即停藥 的短療程治療組 SVR 率只有 35%。快速病毒學反應(第 4 周即檢測不到血清 HCV RNA) 是有效的 SVR 預測指標，含特拉潑維方案組獲得快速病毒學反應 率為 81%，SOC 治療組為 11%。PROVE-2 研究 [13] 采用特拉潑維聯合聚乙二醇化干擾素與利巴韋林組、單聯合聚乙二醇化干擾素組、三藥短期治療組與 SOC 組比較，并評估短療程 ( 12 周與 24 周) 的療 效。結果顯示 3 藥聯合治療 12 周后再用 SOC 鞏固 12 周治療組的 SVR 率高達 69%，病毒突破率僅2%，而 SOC 組 SVR 率為 46%(P=0.004) ；特拉潑 維單聯合聚乙二醇化干擾素 12 周治療組 SVR 率僅 為 36%，而復發率和病毒突破率高達 48% 和 26%。 三種藥物 12 周短期治療組 SVR 率達 60%，與 SOC 組無統計學差異(P=0.12)。兩種研究結果的差異可 能歸因于研究人群的不同，例如宿主藥動學的差異。另外針對 2、3 和 4 型 HCV 感染者的特拉潑維 IIa 期研究顯示，其對 2 型和 4 型感染者有一定療效， 而對 3 型 HCV 感染作用有限 [14,15]。此外，不同類 別 DAA 的活性也有差異，可見，DAA 應用于非 1 型感染仍需要進行更多的臨床研究。與特拉潑維一樣，博賽潑維 ( HCV 絲氨酸蛋白 酶抑制劑 ) 治療 1 型 HCV 感染者的 IIb 期臨床研究 (SPRINT-1, 595 例) 結果 [16] 顯示，含博賽潑維方案 組 SVR 率明顯升高，但 28 周短療程 ( 博賽潑維聯 合聚乙二醇化干擾素和利巴韋林 ) 的 SVR 率 (55%) 低于 48 周療程 ( 66%)。另外此項研究加入了 4 周 SOC 治療導入期，理論上可能通過在 DAA 起始治 療前降低病毒載量以減少 DAA 耐藥突變的發生， 結果發現 28 周療程時導入治療組 ( 4 周聚乙二醇化干擾素合并利巴韋林治療后加用博賽潑維 24 周) 和無導入治療組 ( 博賽潑維合用聚乙二醇化干擾素 和利巴韋林 28 周)的 SVR 率無明顯差異 ( 56% 對 55%)，但 48 周導入治療組 (4 周聚乙二醇化干擾素聯合利巴韋林治療后加用博賽潑維治療 44 周)與無導入治療組 ( 博賽潑維聯用聚乙二醇化干擾素和 利巴韋林治療 48 周)的 SVR 率差異顯著，分別為 74% 和 66%，因此導入治療的策略需要考慮導入 治療療程和隨后聯合治療的時間等，目前尚需更多 研究明確其在 HCV 治療中的作用。正在研究中的 NS3/4A 蛋白酶抑制劑尚有多種，包括 TMC-435、 MK-7009、BI201335、R7227、VX-985 和 ABT-333 等。
3   DAA 能否實現無干擾素的替代治療方案
DAA 的研究日益成熟，逐漸成為有效和可行 的干擾素替代方案并可提高治療的耐受性。在一項 評估特拉潑維單藥治療 1 型 HCV 感染者療效的 Ib 期研究中，14 天治療分為 3 個劑量組 ( 每 8 小時 1次，每次 450、750 或 1 250 mg)，結果所有患者病 毒載量均下降了 2 個 log10 IU/mL 以上，平均下降 約 4 個 log10 IU/mL[17]。然而其他研究 [18] 顯示，藥 物作用位點的變異會導致相當數量的患者出現病毒 突變，如果停用特拉潑維，大多在 3~7 個月內被野 生型病毒取代，但也有少量患者在長達 2 年的時間 內都能檢測出突變株。這些數據提示由于病毒耐藥 突變的快速出現，DAA 單藥治療是無效的。因此， 為了實現長期持續的病毒清除，DAA 聯合其他抗病 毒藥物，包括聚乙二醇化干擾素或者其他 DAA 是 非常必要的。特拉潑維與聚乙二醇化干擾素之間有協同抗病毒 作用 [19]。特拉潑維與聚乙二醇化干擾素聯合用藥比單 用其中任何一種藥物可表現出更好的抗病毒效果，平 均降低 HCV 病毒載量達 5.5 個 log10 IU/mL[19]。此外， 病毒序列分析顯示聯合用藥比 DAA 單藥治療的耐 藥突變少，提示聚乙二醇化干擾素有緩解產生耐藥 突變的作用。在 IIb 期 PROVE 研究中，7%~10% 的 特拉潑維單藥治療患者存在病毒學突破 [12-13]，且高 耐藥型變異 (V36M 變異合并 R155K 變異或 A156T 變異 ) 在發生病毒學突破的患者中多見，但基線耐 藥分析顯示 HCV 對特拉潑維的天然耐藥率極低， 僅為 1%[12]。因此，DAA 單藥聯合聚乙二醇化干擾 素仍然是治療方案的必要組成部分。早期有研究報道 DAA 藥物間的聯合治療療效 與減少耐藥方面的優勢，并且有潛力解除對聚乙二 醇化干擾素和(或) 利巴韋林的依賴。INFORM-1研究 [20] 評估了 DAA 藥物間聯合治療的效果，即 核苷類似物聚合酶抑制劑 R7128 和蛋白酶抑制劑 R7227/ITMN-191 聯用 14 天后加聚乙二醇化干擾素 和利巴韋林鞏固治療，結果顯示初治和經治的 1 型 患者第 13 天即迅速出現 HCV 病毒載量下降，所 有患者都下降了 4~5 個 log10 IU/mL 并且在絕大 部分初治患者中實現病毒抑制 [ 88% 患者的定量 下限 ( LLOQ) <43 IU/mL，63% 患者的 LLOQ<15IU/mL]，其中 1 例患者出現病毒學反跳，但 N53 區域序列分析并未顯示存在針對 R7227 耐藥突變 的證據。1 例患者的基線基因序列顯示 NS3 中存在 E168( 一個與 R7227 耐藥相關的密碼子改變 )，但 經聯合治療后病毒載量持續降低 ( 第 14 天時病毒 載量為 139 IU/mL) 并且在鞏固治療期間實現了病 毒的持續抑制。因此，聯合 2 個或更多 DAA 而不 使用聚乙二醇化干擾素治療是有可能成功的，但仍 需要更多的研究確定這種方案的長期效果以及適合 人群。耐藥問題在所有蛋白酶抑制劑中都普遍存在。 這類耐藥有以下特征 ：首先，體外試驗明確了特拉 潑維和博賽潑維都存在交叉耐藥。其次，數據顯示 耐藥突變型相對于野生型其復制能力降低。再者， 無論體外試驗還是臨床研究，耐藥突變株仍然對聚 乙二醇化干擾素敏感 [21]。此外，目前發現天然的密 碼子改變可導致對 DAA 的耐藥，在藥物作用下該 基線突變容易被選擇出來。如 PROVE2 研究中 1% 的患者在基線水平存在低水平耐藥 [13]。但由于病毒 突變尚難以追蹤，病毒耐藥的長期變化尚待確定。 雖然在艾滋病和乙型肝炎治療中，類似序列分析的 檢測起著指導治療的作用，但序列分析結果無法解 決區分天然突變還是藥物誘導突變的問題。
4   DAA 與利巴韋林
利巴韋林抑制 HCV 復制的作用有限，但與聚 乙二醇化干擾素聯合應用可提高應答率，并且可通 過加速鞏固治療期的病毒下降 ( SVR 的有效預測指 標 ) 阻止停藥后的復發 [22-23]。利巴韋林的抗病毒機 制仍有爭議，它很可能在 DAA 治療的起始階段發 揮作用。PROVE2 研究 [13] 顯示利巴韋林參與的治 療組 SVR 率 (36%)與 SOC 治療組近似，但與無利巴韋林參與的治療組相比，其病毒突破率、復發率 均有明顯下降。這些數據說明，利巴韋林在限制耐 藥突變方面具有重要作用，并能降低疾病復發率。 也許未來 DAA 和其他新藥的聯合應用會限制利巴 韋林的治療作用，但現今它仍然是所有 HCV 治療 方案中的重要組成部分。
5   DAA 與 SOC 方案的耐受性
現今針對 1 型 HCV 的 SOC 治療方案除療效低 下外，另一個嚴重問題是耐受性差，患者易出現流 感樣癥狀、抑郁和貧血。在評價蛋白酶抑制劑特拉 潑維和博賽潑維療效的 II 期臨床研究中，治療中止 率 SOC 組高于 DAA 組 ：PROVE1 研究為 21% 對 11%，PROVE2 研究為 12% 對 7%，SPRINT-1 為27% 對 8%[12-13,16]。此外，和 SOC 組相比，特拉潑 維常可引起皮疹、瘙癢、惡心嘔吐和貧血，而博賽 潑維常見的是貧血和味覺障礙。因此未來的藥物開 發和臨床研究需權衡 DAA 與 SOC 方案中藥物的療 效和毒副作用問題。
6   DAA 與慢性丙型肝炎治療療程
丙型肝炎的療程取決于病毒基因型以及早期病 毒活躍程度，然而，目前對 1 型 HCV 慢性感染者， 標準療程仍是 48 周。各項蛋白酶抑制劑 IIb 期臨床 研究都評估了短期療程的效果。PROVE1 研究顯示 24 周治療組 ( 12 周 3 藥聯合治療加 12 周 SOC)與 48 周治療組 ( 12 周 3 藥聯合治療加 36 周 SOC)結 果相似，均優于僅 12 周 3 藥聯合治療組和僅 48 周 SOC 組 [12]。PROVE2 研究證實 24 周治療組 (12 周 3 藥聯合治療加 12 周標準治療 ) 優于 12 周無利巴 韋林治療組 ( 特拉潑維聯合聚乙二醇化干擾素 ) 及 48 周 SOC 組，相比 12 周 3 藥聯合治療組雖療效相似， 但其復發率較低 (14% 對 29%)[13]。可見療程縮短不 一定會影響療效。而對于博賽潑維，縮短療程不太 可行，因 SPRINT-1 顯示 48 周的 3 藥聯合治療才能 使 SVR 率達到最高 [16]。鑒于不同蛋白酶抑制劑藥 物的最佳療程可能存在偏差，DAA 的療程尚無法統 一。
7   經治患者能否選擇 DAA
PROVE3 作為一項隨機 IIb 期臨床研 究，評 估了特拉潑維聯合聚乙二醇化干擾素和利巴韋林或僅聯合聚乙二醇化干擾素治療 1 型 HCV 感染經 治患者的療效 [24]，結果發現 3 藥聯合 12 周加 SOC 12 周治療組和 3 藥聯合 24 周加 SOC 12 周治療組 的 SVR 率相似 (51% 對 53%)，而僅用 SOC 組為 14%。另外 3 藥聯合治療 24 周加 24 周 SOC 治療 組的 SVR 率與 SOC 組相當，但優于其他各 3 藥聯 合治療組。那些較早出現復發的經治患者療效最 佳，治療 24 周時 SVR 率達 69%，48 周時達 76%， 而無論是治療 24 周還是 48 周，其他經治無應答 患者 SVR 率均為 38%~39%，這個數據接近于目前 SOC 治療 1 型 HCV 感染初治患者的 SVR 率。 這 些數據對所有患者都是令人鼓舞的，尤其是既往 治療中出現病毒學突破或復發的患者。然而，也 有 II 期臨床研究 [25] 顯示在經治無應答者中優先使 用博賽潑維僅獲 7%~14% 的低 SVR 率。但更高 劑量博賽潑維的療效評價有待進一步的研究結果。
8   DAA 局限性盡管報道的數據有限，目前 DAA 發展仍處于 早期，但 DAA 在提高 SVR 率和縮短療程方面具有 廣闊的前景。不過，在提高 DAA 耐受性、降低耐 藥危險性、耐藥檢測的標化、最佳劑量的確定、聚 乙二醇化干擾素與利巴韋林聯用的療程，以及建 立有效治療方案的組合等方面仍有許多工作要做。 DAA 的療效還需要在合并其他疾病的 HCV 感染及 難治性患者中進行評估，例如評價對肝硬化、失代 償肝病、肝移植、腎衰竭和 HIV/HBV 合并感染等 病例的療效。
9   未來丙型肝炎感染治療的發展方向
未來幾年內，DAA 藥物將會與聚乙二醇化干擾 素和利巴韋林聯合用于治療 1 型 HCV 感染的初治 患者，并因此有可能將目前 40% 的 SVR 率提高至 60%~70%。其中 IL28B 基因單核苷酸多態性 (SNP， rs12979860) 的發現具有里程碑意義，它為 SNP 與 目前 HCV 治療應答間建立了關聯，為深入研究針 對 HCV 感染的固有免疫反應機制提供了契機，并 說明了 HCV 免疫反應中干擾素 λ 的作用 [26]。這項 發現已在其他人群中得到確認并且進一步與 HCV 感染的自然清除率相關 [27-29]，如治療 2 周時病毒衰 減速度更快，預示該 SNP 純合子患者有更高的快速毒學應答率等 [30]。該 SNP 及干擾素 λ 在 DAA 起 始階段的作用尚不清楚。由于 DAA 應用時病毒水 平迅速下降，這種多態性的聯系可能會減弱。擁有 該多態性的患者可能僅在聯合應用 DAA 或短期療 程時可獲得 SVR。以 DAA 為基礎和以干擾素為基 礎的不同治療方案聯合很可能將成為慢性 HCV 感 染患者個體治療的一部分。而治療方案的復雜性， 療程長短，耐藥危險性，耐藥序列分析的作用以及 目前治療的長期效果尚待研究。
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