鐘勁，陶萬銀
( 中國科學院上海巴斯德研究所，上海 200025)
摘要: HCV 是全球范圍內導致慢性病毒性肝炎的重要病原體之一。HCV 長期隱匿性感染可能會引發肝纖維化、肝硬化和肝癌 等晚期肝病。干擾素和利巴韋林聯合用藥廣泛用于 HCV 感染的治療，但這一療法治療效果有限，并且具有很強的副作用。HCV 小 分子直接抗病毒藥物( DAA) 的出現大大提高了治療效果，并有望最終完全取代干擾素療法。然而慢性丙型肝炎治療進入 DAA 時 代并不意味著丙型肝炎問題已經解決，丙型肝炎研究依然面對諸多挑戰。
關鍵詞: 丙型肝炎; 直接抗病毒藥物; 綜述
The challenges to hepatitis C research in era of direct antiviral agents
ZHONG Jin，TAO Wanyin．  ( Institut Pasteur of Shanghai，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200025，China)
Abstract: Hepatitis C virus ( HCV) is an important human pathogen that causes chronic viral hepatitis worldwide． HCV infection，often persistent and asymptomatic，could lead to liver fibrosis / cirrhosis and hepatocellular carcinoma．  The interferon / ribavirin therapy has been
widely used for treating chronic hepatitis C，but it is not always effective and has strong side effects． The development of small － molecule di-rect antiviral agents ( DAA) has greatly improved the curing efficiency ofchronic hepatitis C therapeutics and will likely replace theinterfer- on － based therapy in the future． However，these developments do not necessarily suggest that the problems of chronic hepatitis C have been completely solved．  The HCV research is still facing many challenges in this new DAA era．
Key words: hepatitis C; direct antiviral agents; review
HCV 是引起急 / 慢性肝炎、并導致肝硬化和肝癌等晚期肝 病的主要致病因子之一。目前全球約有 1． 85 億 HCV 感染者， 尤其在發展中國家最為嚴重，東亞地區感染率為 3． 7%［1］。20 世紀 90 年代血清流行病學調查資料表明我國一般人群 HCV 抗體陽性率為 3． 2% ，為丙型肝炎高發區。2011 年新的流行病 學調查顯示一般人群 HCV 抗體陽性率為 0.43%［2］，但該數據 沒有涵蓋高感染率的特殊人群，因此我國  HCV  感染者的準確 數字仍有待進一步調查。根據中國衛計委發布的數據，過去 10 年內我國 HCV 新發報告人數每年以 15% 左右的速度增長，2012 年新增感染 20 多萬例。HCV 主要經血液傳播，目前沒有 疫苗，加大了預防的難度。最近針對 HCV 的小分子直接抗病 毒藥物( direct antiviral agents，DAA) 研發取得重要進展，目前 已有 4 種 DAA 在美國獲得批準上市，更多的 DAA 在臨床試驗 中表現良好，可能于今后幾年內獲批。這些 DAA 的出現給丙 型肝炎的研究帶來了一系列新的機遇與挑戰。
1   HCV 及其引發的疾病
    HCV 屬黃病毒科，其基因組是全長約 9600 個核苷酸的單 鏈正義 ＲNA。基因組兩端具有空間結構保守的非編碼區，中 間是長約 9000 個核苷酸的開放閱讀框，翻譯成為一個多聚蛋 白前體，由宿主和病毒自身編碼的蛋白酶加工成 10 個成熟的 病毒蛋白，包括結構蛋白 core、E1 和 E2，離子通道蛋白 p7，非 結構蛋白 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。HCV 有 7 種 主要基因型［3］，不同基因型間的序列差異為 30% ～ 35% 。病 毒基因型可影響抗病毒治療效果、發病進展和疫苗研發。我國 主要流行基因型為 1b 和 2a，近年來新增輸入性基因型感染多 為 3a 和 6a 型。HCV 感染的慢性化率高達 80% ，可引發肝硬 化和原發性肝癌等終末期肝病。HCV 慢性感染還常并發肝外 損害，如冷球蛋白血癥、淋巴瘤以及糖尿病等［4］。
2  丙型肝炎治療的最新進展及其面臨的挑站
   長期以來長效干擾素( PEG － IFN) α 和利巴韋林聯合用藥 是治療慢性丙型肝炎的標準方案，可達到 50%   ～ 60% 持續病毒學應答( sustained virological response，SVＲ) 率。IFN 治療效果受病毒基因型和宿主兩方面的影響，歐美國家丙型肝炎基因1 型患 者 SVＲ 率 只 有 約 40% ，而 基 因 2、3 型 SVＲ 率 可 達 到80%。不同 HCV 基因型對 IFN 應答率差異的原因尚不完全清楚，有報道 NS5A 區域存在 IFN 敏感性決定區域 ( ISDＲ) 影響 IFN 應答［6］，但這一報道并沒有得到領域的認同。宿主方面最 引人矚目是位于  IL － 28B 基 因 ［編 碼 Ⅲ 型 干 擾 素 ( IFNλ3) ］附近的多核苷酸多態性( SNP) 與 IFN 治療效果的相 關性。全基因組關聯性分析表明 rs12979860  SNP 位點為 C 的 丙型肝炎患者接受 IFN  治療效果顯著好于該位點為 T  的患者。 這也部分解釋了不同人群接受  IFN  治療效果的差異，高加索人 群接受 IFN 治療效果好于非洲人群是由于人群中該位點是  C 的比例更高。中國人群 rs12979860  SNP 位點是 C 的比例高達 84%  ～ 95% ，因此中國丙型肝炎 患 者  IFN  治療的療效普遍偏 好［7 － 8］。此外，rs12979860  SNP 位點和 HCV 的自發性清除也 高度相關，HCV 感染自愈者( HCV 抗體陽性、ＲNA 陰性)  攜帶 C 等位點的比例也顯著高于慢性感染者［9 － 12］。rs12979860  位 點影響  IFN  治療效果的機制還有待進一步研究，也是當前研究 熱點之一。最近有研究組報道了和丙型肝炎   IFN   治療療效關 聯性更強的新的雙核苷酸 SNP 位點 ss469415590( TT 或 ΔG) ， 該位點和 rs12979860 位點高度連鎖，ΔG 移碼突變可以產生一 個新的開放閱讀框，編碼新的Ⅲ型干擾素( IFNλ4)[13］。IFNλ4 的表達是否以及如何影響丙型肝炎治療的療效，ss469415590 位點是否影響其他病毒的感染或治療仍然不清楚，有待進一步 研究。與 IFN 抗病毒作用機制不同，DAA 可以直接抑制關鍵的 病毒酶或蛋白。抗 HCV 的小分子 DAA 主要針對 HCV 編碼的NS5B ＲNA 聚合酶、NS3 蛋白酶和 NS5A。2011 年美國批準了 2 種針對 NS3 蛋白酶的抑制劑，Vertex 公司的 Incivek 和默克公 司的 Victrelis，與 IFN 加利巴韋林三重聯合用藥的治療方案，開 創了小分子藥物治療 HCV 的先河。2013 年強生公司針對 NS3的 Olysio 和吉利德公司針對 NS5B 的 sofosbuvir 也獲批上市。 此外還有 10 余種 DAA 進入臨床二期或者三期測試，當前這一 領域正處于快速發展時期。未來有望將 2 種或更多的 DAA 聯 合使用，完全取代 IFN 治療 HCV［5］。也應冷靜地看到，當前這一領域還有許多挑戰: 對部分難 治性 HCV 患者的治療如 HIV / HCV 合并感染、重癥肝病患者等 治療還需要摸索; DAA 的廣泛使用勢必會導致病毒的耐藥性 突變的產生，針對不同 DAA 的耐藥性研究對于丙型肝炎 DAA的個性化治療有著重要意義。此外，現階段 DAA 的高昂費用 也是其廣泛應用一個限制因素，預計新的不依賴 IFN 的 DAA 一個療程需要約 9 萬美元［5］，按此推算即便治愈我國 10% 的 HCV 感染者也需要花費高達數千億美元，對于我國絕大多數患者和醫療系統都是一筆龐大的開支。由于遺傳因素的影響， 我國丙型肝炎患者的  IFN  治療效果明顯優于歐美人群，因此很 有必要開展符合我國國情同時利于我國患者治愈的丙型肝炎 治療方案的研究。
3   DAA 時代下丙型肝炎研究的思考
   3． 1 細胞模型的研究進展和挑戰    回顧 HCV 研究歷史，細胞 模型的建立極大地促進了  HCV  基礎科學研究和新藥開發。 HCV 常用細胞模型有假病毒模型 ( HCVpp ) 、復 制 子 模 型( Ｒeplicon) 和細胞培養 模 型 ( HCVcc)  等。其中細胞培養模型 能夠在體外 模 擬 HCV 完 整 的 生 活 周 期，具有重要的研究價 值［14  － 16］。第一株  HCVcc  模型是基于一例日本爆發性肝炎患 者樣本分離的 2a 基因型克隆( JFH － 1) 建立的。該病毒株具 有很高的體外復制能力，將 JFH － 1 的非結構蛋白和其他病毒 株的結構蛋白組合，構建了具有基因 1 － 7 型結構蛋白的嵌合 病毒［17 － 18］。通過引 入 JFH － 1 骨 架 中 發生的關鍵適應性突 變，建立了 1a、2a 和 2b 型全長感染性克隆［19 － 20］，這些克隆都 是從共有序列來源的實驗室毒株構建。最近筆者建立了一種 從臨床病毒株直接構建  HCV  感染性克隆的新方法，成功構建 了我 國 首 例 HCV 的 感 染 性 克 隆 PＲ63cc，與 JFH － 1 相 比， PＲ63cc 對某些 DAA 敏感性存在顯著差異［21］，說 明 構 建 臨 床 株來源的  HCV  感染性克隆對于評價  DAA  療效具有重要意義。Huh7 及其衍生細胞系 Huh7． 5 和 Huh7．  HLCZ01，不僅能夠較 好地支持細胞培養的 HBV 和 HCV 感染，還可以被臨床 HCV 毒株感染［22］，在研究臨床病毒株耐藥性等方面具有很大的應 用價值。干細胞技術的快速發展為新型感染模型提供了另外 一個發展方向，iPS   細胞經誘導轉化成的肝細胞［23］或者體外直 接轉化的肝細胞 (  iHep) ［24 － 25］ 可用于建立不同遺傳背景的個 性化 HCV 細胞感染模型，用于評價宿主因素對  HCV  感染、病 理和治療等方面的影響。
   3． 2 動物模型的研究進展和挑戰HCV 感染和致病機制的 基礎研究，藥物和疫苗開發均依賴于合適的動物模型。人類是 目前已知唯一的   HCV   天然宿主。除了人類之外，黑猩猩也對 HCV 易感，但感染后病癥較輕。此外黑猩猩數量少、繁殖慢、 使用費用高、動物福利和倫理問題復雜，極大限制了黑猩猩感 染模型應用。建立完善的丙型肝炎小動物模型一直是本領域 的重要目標，近年來也取得了一定的進展。人肝細胞嵌合小鼠 模型能支持 HCV 感染和復制，但該模型制備困難，成本高昂， 并且缺乏針對   HCV   的免疫病理反應。人肝細胞嵌合小鼠模型 中引入部分人免疫系統后得到人源化小鼠模型，該模型可以有 限支持 HCV 感染并伴隨發生部分肝炎病理癥狀，但該模型制 備技術復雜，HCV 感染效率高［26］。
表達支持 HCV 感染的人源宿主因子的小鼠模型是另外一 種研究策略。利用轉基因或者腺病毒載體在鼠肝臟表達 HCV 的受體 / 輔助受體分子 CD81 和 OCLN 后，可檢測到 HCV 瞬間感 染和復 制。抑制小鼠天然免疫反應后可以檢 測 到 更 持 久 的 HCV 復制，且有少量子代病毒產生［27］。如何進一步提高 HCV 在小鼠中的感染效率，在病理上更加接近人體的丙型肝炎發病 進程是本領域的重要挑戰。此外，國內外學者也報道了樹鼩能 被 HCV 一過性感染，但感染的重復性和穩定性還有待提高［28］。
   3． 3 疫苗的研究進展和挑戰   相對于治療上的巨大進展，HCV 疫苗的開發進程緩慢。HCV 具有多種逃避宿主免疫系統 攻擊，建立持續性感染的能力，而且 HCV 變異率高，不同基因 型遺傳差異性大，為廣譜疫苗的開發提出了挑戰［29］。缺乏合 適的小動物感染模型也阻礙了 HCV 疫苗的開發。最近 HCV 包膜蛋白 E2 核心區晶體結構已經解析［30 － 31］，為中和抗體識 別 E2 和疫苗的研發提供參考依據。另外，含有基因 1 － 7 型來 源的結構蛋白的嵌合 HCV 感染性克隆的建立為廣譜疫苗的研 發提供了重要的檢測平臺。由于 T 細胞免疫，尤其是 CD8 + T 細胞在 HCV 的免疫清除中發揮了重要作用，因此研發出可以 同時誘導有效的針對 HCV 的 B 細胞和 T 細胞免疫反應的疫苗 是本領域的重要研究目標。
   3． 4 HCV 致 病 性 研 究 同樣受制于動  物研究模型的不足，HCV 致病性機制目前了解的很少。通常 HCV 的病毒清除會相 應減輕炎癥、纖維化癥狀等，少數患者清除 HCV 后仍然持續發 生肝臟炎癥反應，并繼續加重發展肝纖維化。如果患者在接受 HCV 抗病毒治療前已經發生較重纖維化，即便清除了病毒也可 能會發展成為肝癌［32］。這部分人群中患者的最終康復，仍需要 加大研究 HCV 致病機理、HCV 相關重癥肝病的治療等。
4   總結和展望
    從上世紀 80 年代末 HCV 被發現以來，隨著科學研究的逐 步深入，HCV    的防控取得了令人鼓舞的進展，今后幾年內將可能出現完全不依賴 IFN 的治療方案。然而也應當清醒地看到，當前  HCV  新藥幾乎都是由國外公司研發的，高昂的費用讓國內絕大多數患者和醫療系統都難以承受。考慮到 HCV 感染的隱匿性，開發有效的疫苗仍是預防感染的首選。由于受到市場 因素的影響，企業界對  HCV  疫苗研發的興趣和投入不大，此任務在很大程度上需要得到政府和公共社會資源的支持。如何 立足我國國情，控制 HCV 治療成本，提高預防、治療效果還需
要政策制定者、廣大科研人員、醫務工作者及相關藥物研發企業共同努力，協力配合。
參考文獻:
［1］   WHO．  Guidelines for the screening，care and treatment of persons with hepatitis C infection［M］．  WHO Press，2014:  5 － 122．
［2］   CHEN YS，LI L，CUI FQ，et al．  A sero － epidemiological study on- hepatitis C in China［J］．  Chin J Epidemiol，2011，32( 9) :  888 － 891．( in Chinese)陳園生，李黎，崔富強，等．   中國丙型肝炎血清流行病學研究［J］．  中華流行病學雜志，2011，32( 9) :  888 － 891．
［3］   SMITH DB，BUKH J，KUIKEN C，et al．  Expanded classification of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67 subtypes: updated crite-ria and genotype assignment Web resource［J］． Hepatology，201459( 1) : 318 － 327．
［4］   THOMAS DL．  Global control of hepatitis C:  where challenge meets opportunity［J］．  Nat Med，2013，19( 7) : 850 － 858．
［5］  MANNS MP，von HAHN T．  Novel therapies for hepatitis C － one pill fits all? ［J］．  Nat Ｒev Drug Discov，2013，12 ( 8 ) :  595 －610．
［6］   ENOMOTO N，SAKUMA I，ASAHINA Y，et al．  Comparison of full
－ length sequences of interferon － sensitive and resistant hepatitis C virus 1b．   Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substi-
tutions in the NS5A region［J］． J Clin Invest，1995，96 ( 1 ) : 224－ 230．
［7］   ＲAO H，WEI L，LOPEZ － TALAVEＲA JC，et al．  Distribution and clinical correlates of viral and host genotypes in Chinese  patients
with chronic hepatitis C virus infection［J］．  J Gastroenterol Hepa-tol，2014，29( 3) : 545 － 553．
［8］ SHI X，PAN Y，WANG M，et al． IL28B genetic variation is asso- ciated with spontaneous clearance of hepatitis C virus，treatment re-sponse，serum IL － 28B levels in Chinese population［J］．   PLoS One，2012，7( 5) : e37054．
［9］ THOMAS DL，THIO CL，MAＲTIN MP，et al． Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus［J］． Nature，2009，461( 7265) : 798 － 801．
［10］   TANAKA Y，NISHIDA N，SUGIYAMA M，et al．  Genome － wide association of IL28B with response to pegylated interferon － alphaand ribavirin therapy for chronic hepatitis C［J］． Nat Genet，2009，41( 10) : 1105 － 1109．
［11］   SUPPIAH V，MOLDOVAN M，AHLENSTIEL G，et al．  IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon － alpha and ribavirin therapy［J］．  Nat Genet，2009，41( 10) : 1100 － 1104．
［12］ GE D，FELLAY J，THOMPSON AJ，et al． Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment － induced viral clearance［J］．
Nature，2009，461( 7262) : 399 － 401．
［13］   PＲOKUNINA － OLSSON L，MUCHMOＲE B，TANG W，et al．Avariant upstream of IFNL3 ( IL28B)   creating a new interferon gene IFNL4 is associated with impaired clearance of hepatitis C virus［J］．at Genet，2013，45( 2) : 164 － 171．
［14］   LINDENBACH BD，MEULEMAN P，PLOSS A，et al．  Cell culture － grown hepatitis C virus is infectious in vivo and can be recultured in vitro［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103( 10) : 3805 － 3809．
［15］ ZHONG J，GASTAMINZA P，CHENG G，et al． Ｒobust hepatitis C virus infection in vitro［J］．  Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102( 26) : 9294 － 9299．
［16］ WAKITA T，PIETSCHMANN T，KATO T，et al． Production of in- fectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome［J］． Nat Med，2005，11( 7): 791 － 796．
［17］  GOTTWEIN  JM，SCHEEL  TK，JENSEN  TB，et  al．  Development and characterization of hepatitis C virus genotype 1 － 7  cell culture systems:  role of CD81  and  scavenger  receptor  class B  type I andeffect of antiviral drugs［J］．  Hepatology，2009，49 ( 2 ) :  364  － 377．
［18］ LU J，TAO W，LI Ｒ，et al． Construction and characterization of in- fectious hepatitis C  virus chimera containing  structural  proteins directly from genotype 1b clinical isolates［J］．  Virology，2013，443( 1) : 80 － 88．
［19］  LI YP，ＲAMIＲEZ S，JENSEN SB，et al． Highly efficient full － length hepatitis C virus genotype 1 ( strain TN) infectious  culture system［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109( 48) : 19757 － 19762．
［20］   LI YP，ＲAMIＲEZ S，GOTTWEIN JM，et al． Ｒobust full － length hep- atitis C virus genotype 2a and 2b infectious cultures using mutations i- dentified by a systematic approach applicable to patient strains［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109( 18) : e1101 － e1110．
［21］ LU J，XIANG Y，TAO W，et al．  A novel strategy to develop a ro- bust infectious hepatitis C virus cell culture system directly from a clinical isolate［J］． J Virol，2014，88( 3) : 1484 － 1491．
［22］ YANG D，ZUO C，WANG X，et al． Complete replication of hepati- tis B virus and hepatitis C virus in a newly developed hepatoma cell line［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111 ( 13 ) : e1264 － e1273．
［23］ WU X，ＲOBOTHAM JM，LEE E，et al． Productive hepatitis C vi- rus infection of stem cell － derived hepatocytes reveals a  critical transition toviralpermissiveness during differentiation［J］．   PLoS Pathog，2012，8( 4) : e1002617．
［24］ HUANG P，ZHANG L，GAO Y，et al． Direct reprogramming of hu- man fibroblasts to functional and expandable hepatocytes［J］． Cell Stem Cell，2014，14( 3) : 370 － 384．
［25］ YU B，HE ZY，YOU P，et al． Ｒeprogramming fibroblasts into bi- potential hepatic stem cells by defined factors［J］． Cell Stem Cell， 2013，13( 3) : 328 － 340．
［26］ BUKH J． Animal models for the study of hepatitis C virus infection and related liver disease［J］． Gastroenterology，2012，142 ( 6 ) : 1279 － 1287． e3．
［27］   DOＲNEＲ M，HOＲWITZ JA，DONOVAN BM，et al． Completion of the entire hepatitis C virus life cycle in genetically humanized mice
［J］． Nature，2013，501( 7466) : 237 － 241．
［28］ TAO WY，ZHANG Y，ZHONG J． Progress in the development of ex- perimental animal models of HCV infection［J］． Infect Dis Info，2012， 25( 2) : 71 － 74． ( in Chinese)陶萬銀，張巖，鐘勁． HCV 實驗動物模型研究進展［J］． 傳染 病信息，2012，25( 2) : 71 － 74．
［29］   LIANG TJ．  Current progress in development of hepatitis C virus vac-
cines［J］． Nat Med，2013，19( 7) : 869 － 878．
［30］ KHAN AG，WHIDBY J，MILLEＲ MT，et al．  Structure of the core ectodomain of the hepatitis C virus envelope glycoprotein 2［J］． Na- ture，2014，509( 7500) : 381 － 284．
［31］ KONG L，GIANG E，NIEUSMA T，et al． Hepatitis C virus E2 en- velope glycoprotein  core  structure ［J］．  Science， 2013， 342 ( 6162) : 1090 － 1094．
［32］ LEE YA，FＲIEDMAN SL． Ｒeversal，maintenance or  progression: What happens to the liver after a virologic cure of hepatitis C? ［J］． Antiviral Ｒes，2014，107C:  23 － 30．