HCV 核心抗原測定用于丙型肝炎早期診斷臨床價值的評估

洪 俊1 饒永彩2 李 艷1

1 武漢大學人民醫院檢驗科 武漢 430060

2 武漢生物制品研究所 武漢 430060

摘要 目的:評估HCV 核心抗原ELISA 測定法用于HCV 早期診斷的臨床價值。方法:采用HCV 抗體、HCcAg測定法及熒光定量PCR 對1 948 份未感染HCV 陰性血樣(1 500 份供血者的血樣、400 份體檢的血樣及48 份非HCV 患者血樣)進行了HCV 血清學及分子生物學檢測。結果:對非HCV 感染標本測定結果表明,1 500 份血庫標本中有8 份在初次HCV 核心抗原測定時出現陽性(0.53%)400 份體檢血樣HCV 核心抗原測定結果全陰;48 例住院非HCV 患者HCV 核心抗原檢測結果只有1 例陽性(2 . 08%),上述抗原陽性血樣的HCVPCR 均為陰性,特異性為99. 94%;我們96 份HCV 感染的血樣(55 例來自我院傳染科HCV 患者病人;41 份來自9 套HCV血清panel)進行了HCV 核心抗原測定及HCVRNA 測定,結果表明有91 份HCV 核心抗原測定陽性,敏感性為94 .79%;對9 套HCV 血清panel 測定結果表明,與Anti-HCV 方法相比,HCV 抗原測定及HCV 熒光定量PCR 都能顯著地將HCV 窗口期平均縮短至36 天;方法內及方間精密度的CV 值均小于10%;結論:HCV 核心抗原ELISA 測定法具有與傳統HCV-RT-PCR 相比的高度敏感性及特異性,可以明顯的縮HCV 早期感染窗口期;它應用將會顯著地降低HCV 感染。

關鍵詞 肝炎病毒,丙型;核心抗原;聚合酶鏈反應

中圖分類號 R987.7 文獻標識碼 A 文章編號 1671-8852(2005)01-0000-00

Clinical Value of HCV Core Antigen Enzyme Immunoassay in Early Diagnosis

Hong Jun,Rao Yongcai,Li Yan,et al

Dep artment o f Clinical L ab,Renmin H os p ital,W uhan U ni ve rsit y,W uhan 430060,China

Abstract

Objective:T o assess the performance of a newly developed ELISA for the detection of HCVcore antigen and its suitability for use in the screening of blood units in order to identify infectingsamples that do not contain specific antibodies . Methods:1 500 sera from blood donors,400 generalpopulation samples,48 patient samples(without HCV infection),55 HCV patient samples(HCV RNA-positive,and anti-HCV-negative),3 natural seroconversion panels,and 6 commercialseroconversion panels were tested with HCV IgG anti-body test,core antigen test and RNAPCR test C . Results:Eight (0.53%)blood donor samples,0(0%)general population samples,and 1 (2. 08%)patient samples(without HCV infection)were initially reactive;1sera sampleswas positive on repetition . These 9 samples tested by reverse transcription-PCR were negative.The specificity and sensitivity of HCV core antigen test were 99 . 94% and 94.79% . The reductionin diagnostic window period resulting from use of HCV Core antigen test and RNA PCR inthe 9 panels was equal onaverage to 36 days . The intra- and inter-assay precision of HCV coreantigen assay was less than 10% .Conclusion:The HCV core antigen assay showed high sensitivityand specificity and could obviouslyreduce the windows period of HCV .

Key Words hepatitis C virus;core antigen;polymerase chainreaction

臨床上診斷HCV 感染主要依賴HCV 抗體測定法[1];但由于體內抗體產生周期長達數月[4];處在窗口期HCV 患者是丙型肝炎傳播的重要來源[2 ,5]。雖然,PCR 等技術能有效HCV 攜帶者窗口期[6 ],但該技術存在著操作復雜、費用昂貴等問題[7],顯然目前,PCR 不適用于HCV 普查。HCV 核心抗原是由HCV 基因組保守序列C 區部分編碼而來,近年來研究表明:在丙肝患者中HCV 核心抗原的出現與HCV RNA 水平具有良好的相關性[3];因此,HCV核心抗原的測定是當前用于HCV 早期診斷比較理想方法。目前,檢測HCV 核心抗原,在國內臨床上實際應用還比較少,缺乏相關的應用數據;本研究目就是評估HCV 核心抗原測定用于HCV 早期診斷的特異性、敏感性以及在縮短HCV 窗口期診斷時間上的可行性及臨床價值;為該方法用于臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1 .1 血清學檢測方法 HCV 核心抗原測定系統采用的是美國Ortho Diagnostics 公司的HCV 核心蛋白ELISA 試劑盒[3] ,其反應原理是采用的雙抗體夾心法;;具體操作方法見Ortho Diagnostics 試劑盒說明;結果判斷:反應結束后用酶聯免疫測定儀于492nm 波長處讀取測定孔的OD 值;,凡測定標本OD 值小于臨界值(CO)的為陰性(CO = 0 . 04 + 3 個陰性對照孔OD 均值);OD 在80%× 臨界值(CO)～1× 臨界值(CO)之間為可凝;OD 在120 %× 臨界值～ 1× 臨界值為弱陽性,OD 大于120 % × 臨界值為強陽性。HCV 抗體(IgG)測定系統采用的是北京萬泰藥業公司及深圳月亮彎公司的HCV 抗體ELISA試劑盒,具體操做方法見試劑盒說明。

1 .2 分子生物學檢測方法 HCV RNA 的檢測采用的是瑞士Roche 公司LightCycler 熒光定量PCR儀及其相應試劑盒,其測定最大靈敏度為500 拷貝/ml,結果判斷,>1× 103 為陽性, <1× 103 為陰性;具

體操作見試劑合說明。

1 .3 采用質控品對HCV 抗體和RNA 測定進行質量控制(質控品均來源于衛生部臨檢中心的HCV質控血清)。

1 .4 血樣 未感染HCV 血樣:2001 年8 月～ 2001年10 月間我院血庫供血樣1 500 份;2002 年3 月～9 月間我院的體檢人群血樣400 份;以及2001 年9月～ 2002 年11 月于我院住院的非HCV 患者血樣48 份,(其中5 例為HAV 抗體陽性,20例為HBV抗原陽性,8 例為自身免疫性肝炎;4 例為HBV 抗原及HDV 抗體陽性;6 例RF 因子陽性,5 例抗核抗體陽性). HCV 感染血樣:55 例2001 年7 月～ 2002年10 月我院傳染科住院HCV 患者(HCV RNA 定量PCR 陽性、抗HCV 陰性血樣);9 套HCV 血清panel(每套panel 包含從HCVRNA,到anti-HCV陽性的系列血樣),其中商業途徑獲得有6 套(6227,6225,9041 購自bioclinical Partners;PHV903,904,919 購自Boston Biomedica;),自已收集3 套(N01、N02、N03;采集自我院HCV 患者)。

1 .5 實驗的設計及結果的分析

1 .5 .1 特異性評估 為評估HCV 核心抗原測定方法的特異性,我們對1 948 份未感染HCV 陰性血樣(1 500 份血庫供血者的血樣、400 份我院體檢的血樣及48 份非HCV 患者血樣)進行了HCV 血清學及分子生物學檢測;首先采用兩種ELISA 方法對HCV 抗體進行了測定,所有標本全部陰性;然后將上述標本全部進行HCV 核心抗原測定,凡初次陽性的標本再復查一次;并用定量PCR 進行確證。

1 .5 .2 敏感性及HCV 早期診斷應用價值評估我們應用HCV 核心抗原測定方法及HCV 熒光定量PCR 對55 例我院傳染科住院病人(HCV 定量PCR 陽性、抗HCV 陰性血樣)及9 套HCV 血清panel 進行了測定。

1 .5 .3 核心抗原方法內及方法間精密度評估

1.5 .3 .1 方法內精密度評估 選取HCV 感染血清中HCV 核心抗原測定結果強陽性的標本A(S/CO = 1 .8),進行HCV 抗原檢測,10 孔/ 次;結果以S/ CO 值表示,計算其均數及CV 值。

1.5 .3 .2 方法間精密度評估 選取兩份HCV 感染血清中HCV 核心抗原測定結果強陽性的標本A(與方法內精密度測定使用的血清相同),B(B 血清為重新選取的HCV 核心抗原強反應血樣S / CO =3);對上述血清分別進行5 次HCV 抗原重復檢測,2 孔/ 每次;上述結果以S/ CO 值表示,并計算其均數及CV 值.

1 .6 統計學方法采用SAS 分析軟件計算均數和CV 值,并參考特異性和敏感性公式計算特異性和敏感性,以P <0 .05 為有統計學差異。

2 結果

2 .1 特異性 表1、表2 表明1 500 份血庫標本中有8 份在初次HCV 核心抗原測定時出現陽性(0 .53%)其中弱陽性標本3 份;S/ CO 值的分布表明;在1 500 份血樣中有1492 份HCV 核心抗原陰性,S /CO 值小于0 . 5 有1 467 份(98 .32%);S/ CO 值在0.5～ 0 .79 之間的有21 份(1.4%),S / CO 值在0.8～ 0 .99 的有4 份(0.27%),對8 例初次陽性反應的標本進行HCV 核心抗原復查,結果表明有1 例陽性(0 .07%),用HCV RT-PCR 對上述8 例標本進行確證,結果全為陰性. 400 份體檢血樣HCV 核心抗原測定結果全陰,S / CO 值均小于0 . 5;其HCV RTPCR均為陰性;48 例住院非HCV 患者HCV 核心抗原檢測結果只有1 例陽性(2 .08%),該標本復查后S / CO 小于0 .5;HCV RT-PCR 確證結果為陰性。

表1 特異性評估中的HCV 核心抗原測定結果(%)

表2 特異性評估中的HCV 核心抗原初次測定結果S /CO 值分布表(%)

2 . 2 敏感性 55 例我院傳染科HCV 患者血樣(HCV 定量PCR 陽性、抗HCV 陰性血樣)HCV 核心抗原測定結果中,有52 例出現陽性(94 .55%),S /CO 值均大于1. 2;有3 例(P01、P02、P03)出現陰性,其中有一例結果在可疑范圍內(具體結果見表3),復查后S / CO 值小于0 .5;

表3 55 例傳染科HCV 患者血樣中3 例HCV 核心抗原檢測結果陰性樣本的S /CO 值及HCVRNA 拷貝數

HCV 血清panel 的HCV-核心抗原,HCV-RNA 及抗HCV 抗體測定結果表明(見表4);9 套血清中有7 套HCV 血清panel 的HCV-核心抗原,HCV-RNA 初次出現陽性結果時間完全一致;有2 套不一致,編號N03 血清panel的HCV RNA 血清初次陽性結果時間比HCV-核心抗原結果提前3 d,編號6227 商業血清panel 的HCV RNA 血清初次陽性結果時間比HCV-核心抗原結果提前1 d. 應用HCV-核心抗原與HCV-RNA測定分別使HCV 窗口期縮短的平均時間分別是35 .8(21～ 78)d 和36 .6(22～ 78)d;上述9 套血清panel 中總共有41 份HCVRNA 陽性,抗HCV 抗體陰性血清,其中39 份HCV 核心抗原測定陽性(95 .12%)。

表4 HCV-核心抗原、HCV-RNA、ANTI-HCV 檢測在縮短HCV 窗口期的時間對比表

2 .4 方法內及方間精密度 如表5 所示方法內及方法間離散指數CV 值均小于10%。

 表5 方法內及方間精密度評結果

3 討論

  20 世紀90 年代以來,臨床上診斷HCV 感染主要利用基因工程表達HCV 抗原構成的ELISA 法來測定抗HCV 抗體;但由于HCV 感染患者體內抗HCV 抗體的產生需一定的時間周期,此時間在普通人最長可至2 個月,免疫缺陷患者則可高達12 個月[4],此間,HCV 病毒可大量存在于病毒攜帶者的外周血中而不被查覺,因此,處在窗口期的HCV 患者是目前輸血性肝炎傳播的一個重要來源[5 ]。雖然,一些分子生物學技術如RT-PCR、bDNA-PCR能有效地將HCV 攜帶者的窗口期縮短至15 到20d[6],然而上述技術存在著操作復雜、對人員及設備要求高及費用昂貴等問題[7],在現階段,PCR 不適用于HCV 普查,因此,當前急需一種,簡單快捷、費用低、具有高度敏感及特異性的方法用于HCV 抗體陰性的血源篩查。

HCV 核心抗原測定是近年來國際上出現的一種新的測定方法,國外的研資料表明它與HCVRNA存在著很好的相關性,可用于HCV 早期診斷[3],但國內對于該法的應用還處于初始階段,缺乏持這種方大規模應用的較為完整臨床實驗數據還比較,因此,在國內對該法的臨床應用價值作了全面考查. 以為臨床應用提供完整的實驗依據。

特異性,對1 948(1 500 + 400 + 48)例非HCV感染的血樣的測定表明,在非HCV 標本中有1 946例HCV 核心抗原結果陰性(99 . 94%),有9 份的血樣出現陽性(0 .46%),特異性為99. 94%;完全達到目前公認的一些用于篩查輸血感染疾病ELISA方法的要求[8 ,9 ];對9 份血HCV 核心抗原陽性的血樣進行HCV 核心抗原復查及HCV 熒光定量PCR測定,結果HCV 核心抗原復查仍有1 份血樣為陽性;而HCV 熒光定量PCR 結果均為陰性;分析原因可能是HCV 核心抗原測定假陽性,及PCR 的假陰性所致(血樣中HCVRNA 低于500 拷貝);此外,在核心抗原方法測定陰性的結果中有1 914 份(98 .35%)血樣S / CO 小于0 . 5,僅有4 例(2.05%)結果出現可疑范圍;顯示出良好的結果判別能力。

在敏感性,我們對96 份HCV 感染的血樣(HCV 定量PCR 陽性、抗HCV 抗體陰性,55 例來自我院傳染科HCV 患者病人;41 份來自9 套HCV血清panel)進行了HCV 核心抗原測定及HCVRNA測定,結果表明有91 份HCV 核心抗原測定陽性,敏感性為94.79%,1 份結果可凝(1.04%);對9套HCV 血清panel 測定,結果表明,與抗HCV 抗體方法相比,HCV 抗原測定及HCV 熒光定量PCR 都能顯著地將HCV 窗口期平均縮短至36 d(HCV 核心抗原測定:35 .8 d;HCV-RT-PCR:36.6 d);本研究結果顯示HCV-核心抗原ELISA 方法的敏感性達到PCR 方法的水平。

   在綜上所述,HCcAg ELISA 測定法具高度敏感性及特異性,可以明顯縮短HCV 窗口期,適用于HCV 普查。

參考文獻：

1 郝飛,余宙耀.丙型肝炎的基礎與臨床. 北京:人民衛生出版社,1998,241～ 248

2 Van der Poel C L . Hepatitis C virus and blood transfusion:past and present risk. J Hepatol,1999,31:101

3 Nubling CM,Unger G,Chudy M,et al. Sensitivity ofHCV core antigen and HCV RNA detection in the earlyinfection phase. Transfusion,2002,42(8):1 037

4 Van der Poel CL,Cuypers H T,Reesink HW. HepatitisC virus six years on. Lancet,1994,344:1 475

5 Schreiber GB,Busch MP,Kleinman SH,Korelitz JJ.The risk of trasfusion trasmitted viral infections . TheRetrovirus Epidemiology Donor Study N Engl J Med,1996,334:1 685

6 Muller-Breitkreutz K,Baylis SA,Allain J. Nucleic acidamplification tests for the detection of blood-borne viruses.Vox Sang,1999,76:194

7 Poljak M,Seme K,Koren S . Evaluation of the automatedhepatitis C virus PCR system. J Clin Microbiol,1997,35:2 983～ 2 9888 Decker RH,Zuckermann AJ,Thomas HC. Viral hepatitis:Scientific basis and clinical management. New York :Churchill Livingstone,1993,165～ 184

9 World Health Organization . Operational characteristics ofcommercially available assays to determine antibodies toHIV-1 and/ or HIV-2 in human sera Report 3 Global Programmeon AIDS/ RES / DIA /91. 1 . Geneva: WHO,1991,356～ 358

(2004-06-29 收稿)

編輯 孫孝云