乙型肝炎和丙型肝炎的實驗室檢查方法進展

崔紅花,謝 風

(吉林大學中日聯誼醫院檢驗科,吉林長春130033)

　 隨著實驗室檢查方法進展,對乙型肝炎和丙型肝炎的早期診斷、預防和治療水平有很大的提高^{[1 ]} , 現就有關研究進展做一綜述。

1 . 乙型肝炎的檢測

乙型肝炎病毒是DNA 病毒。1965 年Blumberg在澳大利亞土著人血清中發現與乙型肝炎病毒相關的抗原,到1973 年確定為乙型肝炎表面抗原(HBVsAg) 。用HBsAg 采用的免疫沉淀法作為臨床檢測,開創了我國對乙型肝炎病毒抗原的檢測。先后采用了瓊脂免疫擴散和對流免疫電泳法來檢測HBsAg、HBsAb 和HBeAg、HBeAb ,但這些檢測方法的特異性及敏感性都較差。至70 年代初被一系列間接免疫凝集試驗取代,包括間接血凝試驗、免疫粘附血凝試驗和乳膠凝集試驗等,使敏感性和特異性有所提高^{[2 ]} 。為進一步提高檢測的敏感性,在同期還開展了放射免疫電泳自顯影法,但其操作費時(4～5 天)廢物難以處理。至80 年代中期開始,以上技術逐步為EL ISA 技術取代。90 年代使用膠體金層析實驗(GICA) 操作更于簡便化、短時間內迅速檢測到血清標志物。同期HBV DNA 檢測也迅速得到發展,采用了PCR 技術和基因芯片技術檢測HBV DNA ,大大提高了敏感性和特異性。

1. 1 　反向被動血凝　在臨床上反向被動血凝方法檢測表面抗原曾在相當一段時間占居了重要地位,直至為EL ISA 法完全取代。前者用表面抗體致敏0 型紅細胞,將病人血清連續2 倍稀釋與其反應一定時間后肉眼觀察凝集現象判斷表面抗原滴度。此法的特別之處在于可以對表面抗原做相對定量,因此頗受臨床醫生的歡迎,但操作復雜是其缺點。

1. 2 　酶聯免疫實驗( ELA) 　20世紀70 年代盛樹力等開始將酶鏈免疫吸附實驗( EL ISA) 方法介紹至國內,其發展迅速,很快覆蓋了醫學檢驗的諸多領域。雙抗體夾心法是其中的代表。單克隆抗體的加入增加了檢測的特異性;用辣根過氧化物酶標記鏈親合素(替代卵親合素以降低本底) 與生物素標記的一抗(單克隆抗體) 聯用構成了高特異性、高敏感度的放大系統,此法靈敏度可達ng 水平^{[3 ]} 。

1. 3 　基因診斷　基因診斷是以檢測感染者體內病毒核酸的有無,或含量多少來進行病原學診斷的一種方法,是從80 年代斑點雜交開始的一種分子生物學技術,90 年代以后PCR 技術迅速發展,且具有特異性好、靈敏性高、操作簡便、易于自動化,因而取代了斑點雜交等臨床檢測技術^{[4 ,5 ]} 。實驗醫學中所用的PCR 包括幾年前應用的巢式擴增、原位PCR、連接酶鏈反應和近年來發展起來的轉錄依賴的放大系統、連替代擴增、實時熒光PCR 定量檢測技術等^{[6 ]} 。其中實時熒光定量PCR 具有省時、不易引起污染、費用相對較低等優點, 目前正在臨床上廣泛應用^{[7 ]} 。病毒性肝炎的基因診斷包括病毒基因的種類、含量、基因分型、亞型和變異等的診斷。雖然乙型肝炎的診斷不需要進行核酸的監測,但抗病毒治療時,血清中的病毒核酸含量是反映病毒數量和病毒復制活躍程度最可靠的直接指標,因此病毒核酸檢測顯得必不可少,特別是乙肝e 抗原陰性患者,它是動態觀察療效的確切指標。隨著PCR 技術的迅速發展近年來基因芯片的發展更加迅猛,基因芯片是基于計算機芯片,分子雜交,微電子和高分子化學合成相結合的綜合技術。

基因芯片技術為肝炎病毒診斷提供了一種快速、敏感、高通量、高效的方法^{[6 ]} 。它可以同時對多種肝炎病毒的各亞型、變異株、耐藥性等情況,通過一張芯片同時診斷出來,可為臨床病毒性肝炎的診斷、用藥、療效判定及疾病的發生、發展與轉歸提供可靠依據。但該技術成本高,芯片的制備比較復雜、樣品準備與標記較為繁瑣、信號檢測靈敏度也有待于進一步提高, 使該技術的普及與推廣存在一定的難度^{[8 ]} 。

2 .丙型肝炎的檢測

丙型肝炎病毒是單鏈RNA 病毒^{[9 ]} ,1989 年發現。HCV 的研究與檢查已經取得了很多發展[10 ] ,我國HCV 感染試劑的研究基本與國外同步^{[2 ]} 。

2. 1 　ELISA 1989年美國Chiron 公司首次研制出診斷HCV 抗體的第一代EL ISA 診斷試劑盒用于獻血員的篩選和臨床檢測,但假陽性問題突出,靈敏度差,不能早期診斷^{[11 ]} 。第二代抗2HCV 試劑盒用HCV 核心抗原和非結構區抗原包被微量板空,結果檢測到抗2HCV 時間較第一代早16～24 日,具有一定的早期診斷價值,敏感性和特異性有了很大的提高。EL ISA 第三代則是在第二代基礎上增加了NS5 抗原,此區分子量最大,而且序列較為保守,含有多個穩定的線性抗原表位,從而敏感性和特異性進一步提高。此后,有人用HCV5 (末端核心區作為抗原來源,合成一個含36 個氨基酸的多肽CP9 ,并包被在反應板上,用EL ISA 法測定血清中CP9 抗體,結果發現CP9 出現早于抗C100 ,因此前者作為早期診斷指標較后者更好。后來又在核心區CP9上有合成多肽CP10 ,用其作包被抗原進行檢測,結果與抗CP9 有效的一致性,兩者同時檢測可明顯提高HCV 感染的檢出率。因其合成肽作為包被材料,所以較好地避免了重組蛋白中夾雜的SOD 多肽造成的假陽性。

2. 2 　重組免疫印跡法檢測HCV抗體　Ebeling 等人將C100多肽和52121 亞基因在大腸菌中表達的抗原52121 包被在硝酸纖維素帶上檢測CP100 抗體,稱免疫印跡試驗( Recom2binant Im mune Blot As2say ,RIBA) 。因采用的抗原與CP100 基因緊密相關,所以不能克服C100EL ISA 法的缺點。第二代RIBA 在第一代的基礎上增加了另外3 個重組多肽(分別來自HCV 基因組的非結構區NS4 和核心區) ,第三代則是在第二代基礎上又增加了NS5 區抗原。第二代RIBA 的靈敏性和特異性明顯高于第一代,而第三代在目前抗體診斷中檢出率最高。現世界各地均使用RIBA22 或RIBA23 試劑,降低了HCVEL ISA 診斷試劑在檢測低危人群中所產生的假陽性結果,但RIBA 操作復雜。近幾年新建立的斑點免疫滲濾試驗(DIFA) 和斑點免疫層析實驗(DICA) 操作異常簡便而又不失穩定性、特異性和靈敏性,具有巨大的推廣價值。

2. 3 　固相酶免實驗檢測抗體　Toniutto 等人還報導用固相酶免實驗檢測丙肝的核心抗體IgM ,本法在HCV 感染的靜脈藥癮者,尤其是感染HCVIa 型者中有較高的檢出率。

2. 4 　EIA 檢測丙肝核心抗原　標本僅需30 min 用3 種不同洗滌成分的液體一次性預處理,不需要特殊的儀器。在感染的初期抗2HCV 尚未出現時即可檢測出HCVAg ,可用于HCV 感染的早期診斷,比基因技術檢測HCV RNA 簡單,同時敏感性好、特異

性高。

2. 5 　基因診斷　主要有RT2PCR、核酸分子雜交和免疫2PCR^{[12 ,13 ]} 。國外已普遍開展HCV 基因擴增方法,直接檢測HCV2RNA ,確定體內有病原體存在,且反映其復制情況, 以達到早期特異有效確診^{[13 ]} 。用PCR 檢測HCV RNA 靈敏度高,可檢測出低于黑猩猩最小感染劑量(CID/ ml) 1/ 10 的HCVRNA。任何黑猩猩感染HCV 后1～2 周,血清中即可檢測到HCV RNA。因此,PCR 可用于早期診斷。HCV RNA 陽性說明HCV 仍在復制,所以它有助于鑒別活動性HCV 感染或既往感染。PCR 法檢測HCV RNA 的局限性在于檢測技術過程復雜,需要特殊的儀器、耗時及價格昂貴而不宜推廣。

參考文獻:

[ 1 ]Labiratory. Diagrosis of vinel hepatitis Bcand C Acta Med Lvoatica.2005 ,59 (5) :405.

[2 ]陶其敏,魏　來. 我國病毒性肝炎病原學診斷的發展和展望[J ] .中華檢驗醫學雜志,2003 ,26 :723.

[3 ]王　健,閔福援. 乙肝病毒血清標志物的檢測方法及臨床意義[J ] . 中華檢驗醫學雜志,2005 ,28 :113.

[4 ] Fagan EA ,Guarnerp , Pera SD ,et al. Quantition of hepatitis B virusDNA (HBV) in serum using the spot . Hybridization technique andscintiuation counting[J ] . Jvirolm othods ,1986 ,12 (3 - 4) :251.

[ 5 ]Scaglioni pier Paolo ,Melegari Margherita ,Wands Jack R1Recent ad2vances in the molecular biology of hepatitis B virus.Bailliere ,s Clini2cal Gastroenterlogy ,1996 ,10 (2) :207.

[ 6 ]Lisby G. Application of nucleic acid amplification in clinical microbi2ology[J ] . Mol Biothechnol ,1999 ,12 :75.

[7 ]Weiss J ,Wu J ,Fsrrenkopf B ,et al. Real time Taq Man PCR detec2tion and quantitation of HBV genotype A2G with the use of an inter2nal quantition standard [ J ] . Journal of Clinical Virology , 2004 , 30 ,(1) :86.

[8 ]劉彥華,全文斌,吳小意,等. 生物芯片技術及其應用前景[J ] . 中華檢驗醫學雜志,2000 ,23 (3) :177.

[ 9 ]Simmonds P. Virology of hepatitis C virus[J ] . Clinical Therapeutics ,1996 ,18. (Supplement2) :9.

[ 10 ] Erensoy Selda. Diagnosis of hepatitis C virus ( ucv) infection andlaboratory monitoring of its therapy. Journal of clinical virology ,2001 ,21 (3) :271.

[ 11 ] Scbreber GB ,Bush MP , Kleinman SH ,et al. The risk of transfu2sion2transmitted viral infections epidemiology donor study [ J ] . NEng J Med ,1996 ,334 (26) :1685.

[ 12 ] Tang. Yi2wei ,Li. haijing ;Roberto. Ann et al. Detectyion of hepatitisC virus by a user2develoed reverse tuanscriptase2PCR and use ofamptification productus for subsequent genotyping ,Journal of clini2cal virology ,2004 ,31 (2) :148.

[ 13 ]Cony2Cantilena ,Cathy. Hepatitis C virus diagnosis :tcchnology ,clin2ical applications and impacts[J ] . Trends in Biotechnology ,1997 ,15(2) :71.

[14 ]Roth wk ,Weber M ,Serfried E. Feasibitity and efficacy of routinePCR screening of blood clonations for hepatitis c virus , hepatitisBvirus ,and HIV21 in a blood2band setting [ J ] . Lancet , 1999 , 353(9150) :359.